Denne protokol præsenterer hurtig antimikrobiel følsomhedstest (AST) assay inden for 2,5 timer ved enkeltcellestimuleret Raman-spredningsbilleddannelse af D2O-metabolisme. Denne metode gælder for bakterier i urin- eller fuldblodsmiljøet, hvilket er transformerende for hurtig enkeltcellet fænotypisk AST i klinikken.
For at bremse og forhindre spredning af antimikrobielt resistente infektioner er der et presserende behov for hurtig antimikrobiel følsomhedstest (ASAT) for kvantitativt at bestemme de antimikrobielle virkninger på patogener. Det tager typisk dage at gennemføre AST ved konventionelle metoder baseret på langtidskulturen, og de fungerer ikke direkte for kliniske prøver. Her rapporterer vi en hurtig AST-metode muliggjort af stimuleret Raman-spredning (SRS) billeddannelse af deuteriumoxid (D2O) metabolisk inkorporering. Metabolisk inkorporering afD2O i biomasse og metabolisk aktivitetshæmning ved eksponering for antibiotika på enkeltbakterieniveau overvåges ved SRS-billeddannelse. Enkeltcellemetabolismeinaktiveringskoncentrationen (SC-MIC) af bakterier ved eksponering for antibiotika kan opnås efter i alt 2,5 timers prøveforberedelse og påvisning. Desuden er denne hurtige AST-metode direkte anvendelig på bakterieprøver i komplekse biologiske miljøer, såsom urin eller fuldblod. SRS metabolisk billeddannelse af deuteriuminkorporering er transformativ for hurtig enkeltcellet fænotypisk AST i klinikken.
Antimikrobiel resistens (AMR) er en voksende global trussel mod effektiv behandling af infektionssygdomme1. Det forudsiges, at AMR vil forårsage yderligere 10 millioner dødsfald om året og et globalt BNP-tab på 100 billioner dollars inden 2050, hvis der ikke træffes foranstaltninger til bekæmpelse af antibiotikaresistente bakterier 1,2. Dette understreger det presserende behov for hurtige og innovative diagnostiske metoder til test af antibiotikafølsomhed (AST) af infektiøse bakterier for at bremse fremkomsten af antibiotikaresistente bakterier og reducere den relaterede dødelighed3. For at sikre det bedst mulige kliniske resultat er det afgørende at indføre effektiv terapi inden for 24 timer. Imidlertid kræver den nuværende guldstandardmetode, som diskdiffusion eller bouillonfortyndingsmetode, normalt mindst 24 timer til præinkubationsproceduren for kliniske prøver og yderligere 16-24 timer for at opnå resultaterne af den minimale hæmmende koncentration (MIC). Samlet set er disse metoder for tidskrævende til at styre en øjeblikkelig beslutning om behandling af infektionssygdomme i klinikken, hvilket fører til fremkomsten og spredningen af antimikrobiel resistens4.
Genotypiske AST-metoder, såsom polymerasekædereaktion (PCR)-baserede teknikker5, er blevet udviklet til hurtig påvisning. Sådanne teknikker måler de specifikke resistensgenetiske sekvenser for at give hurtige AST-resultater. De er ikke afhængige af tidskrævende cellekultur; Det er dog kun specifikke kendte genetiske sekvenser med resistens, der testes. Derfor er dens anvendelse begrænset til forskellige bakteriearter eller forskellige resistensmekanismer. De kan heller ikke give MIC-resultater for terapibeslutninger 6,7. Desuden er nye fænotypiske metoder til hurtig AST under udvikling for at overvinde disse begrænsninger8, herunder mikrofluidiske enheder 9,10,11,12,13, optiske enheder14,15,16, fænotypiske AST-kvantificering af nukleinsyrerne kopinummer17,18 og Raman-spektroskopiske metoder 19, 20,21,22,23,24. Disse metoder reducerer tiden til at guide AST-resultater, men de fleste af dem gælder kun for bakterieisolater, ikke direkte til kliniske prøver, og kræver stadig langvarig præinkubation.
I dette arbejde præsenterer vi en metode til hurtig bestemmelse af følsomheden af bakterier i urinen og fuldblod via overvågning af den cellulære metaboliske aktivitet ved SRS-billeddannelse. Vand (H2O) deltager i langt de fleste essentielle biomolekylære synteseprocesser i levende celler. Som en isotopologue af vand gennem enzymkatalyseret H/D-udvekslingsreaktion mellem det redoxaktive hydrogenatom i NADPH og D-atomet iD2O kan deuterium inkorporeres i biomasse inde i en celle25,26. En deutereret fedtsyresyntesereaktion medieres af deuterium mærket NADPH. D2O-inkorporeringen i reaktioner af aminosyrer (AA’er) resulterer i den deutererede proteinproduktion26 (figur 1). På denne måde kan de nyligt syntetiserede CD-bindingsholdige biomolekyler i enkelte mikrobielle celler anvendes som en generel metabolisk aktivitetsmarkør, der skal detekteres. For at aflæse de novo syntetiserede CD-bindinger anvendes Raman-spektroskopi, et alsidigt analytisk værktøj, der giver specifik og kvantitativ kemisk information om biomolekyler, i vid udstrækning til at bestemme antimikrobiel modtagelighed og reducere testtiden betydeligt til et par timer27,28,29,30 . På grund af den iboende lave effektivitet af Raman-spredningsprocessen er den spontane Raman-spektroskopi imidlertid af lav detektionsfølsomhed. Derfor er det udfordrende at opnå billedresultater i realtid ved hjælp af spontan Raman-spektroskopi. Sammenhængende Raman-spredning (CRS), herunder sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimuleret Raman-spredning (SRS), har nået høj detektionsfølsomhed på grund af det sammenhængende lysfelt for at generere størrelsesordener større end spontan Raman-spektroskopi, hvorved højhastigheds-, specifik og kvantitativ kemisk billeddannelse på enkeltcelleniveau 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
Her, baseret på vores seneste arbejde40, præsenterer vi en protokol til hurtig bestemmelse af den metaboliske aktivitet og antimikrobielle modtagelighed ved femtosekund SRS C-D-billeddannelse af D2O-inkorporering af bakterier i det normale medium, urin og fuldblodsmiljø på enkeltcelleniveau. Femtosekund SRS-billeddannelse letter overvågning af enkeltcellemetabolismeinaktiveringskoncentration (SC-MIC) mod antibiotika på enkeltbakterieniveau inden for 2,5 timer. SC-MIC-resultaterne valideres ved standard MIC-test via bouillonmikrofortynding. Vores metode er anvendelig til bestemmelse af antimikrobiel modtagelighed af bakterier urinvejsinfektion (UTI) og blodbaneinfektion (BSI) patogener med en meget reduceret analysetid sammenlignet med den konventionelle metode, hvilket åbner mulighed for hurtig fænotypisk AST i klinikken på enkeltcelleniveau.
Hurtig AST kan opnås ved at vurdere responsen af bakteriel metabolisk aktivitet på antibiotikabehandling ved hjælp af enkeltcellet SRS metabolisk billeddannelse inden for 2,5 timer fra prøven til SC-MIC-resultater. Responsen af bakteriel metabolisk aktivitet og antimikrobiel modtagelighed kan detekteres ved at overvåge den metaboliske inkorporeringaf D2O til biomolekylesyntese ved hjælp af SRS-billeddannelse af CD-bindinger. Da vand er allestedsnærværende anvendt i levende celler, giver SRS metabolisk …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH R01AI141439 til J.-X.C og MS og R35GM136223 til J.-X.C.
Acousto-optic modulation | Gooch&Housego | R15180-1.06-LTD | Modulating stokes laser beam |
Amoxicillin | Sigma Aldrich | A8523-5G | |
Bandpass filter | Chroma | HQ825/150m | Block the stokes laser beam before the photodiode |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016-100G | Cation adjustment |
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth | Fisher Scientific | B12322 | Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002542 | |
Cover Glasses | VWR | 16004-318 | |
Culture tube with snap cap | Fisher brand | 149569B | |
Daptomycin | Acros | A0386346 | |
Deuterium oxide | 151882 | Organic solvent to dissolve antibiotics | |
Deuterium oxide-d6 | Sigma Aldrich | 156914 | Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system |
Escherichia coli BW 25113 | The Coli Genetic Stock Center | 7636 | |
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher brand | 05-408-129 | |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G4918 | |
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters | Millipore-Sigma | SLSV025NB | pore size 5 µm |
ImageJ software | NIH | Version: 2.0.0-rc-69/1.52t | Image processing and analysis |
Incubating orbital shaker set at 37 °C | VWR | 97009-890 | |
Inoculation loop | Sigma | BR452201-1000EA | |
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | Model: insight X3 | Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | Demodulate the SRS signals |
Oil condenser | Olympus | U-AAC | NA 1.4 |
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) | American Type Culture Collection | ATCC 47085 | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | Detector |
Polypropylene conical tube 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
Polypropylene filters | Thermo Scientific | 726-2520 | pore size 0.2 µm |
Sterile petri dishes | Corning | 07-202-031 | |
Syringe 10 mL | Fisher brand | 14955459 | |
UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU 530 | Measuring optical density at wavelength of 600 nm |
Vortex mixer | VWR | 97043-562 | |
Water objective | Olympus | UPLANAPO/IR | 60×, NA 1.2 |