JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Abstract

Om de verspreiding van antimicrobieel resistente infecties te vertragen en te voorkomen, is het dringend noodzakelijk om de antimicrobiële effecten op pathogenen kwantitatief te bepalen. Het duurt meestal dagen om de AST te voltooien met conventionele methoden op basis van de langdurige cultuur, en ze werken niet direct voor klinische monsters. Hier rapporteren we een snelle AST-methode die mogelijk wordt gemaakt door gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) beeldvorming van deuteriumoxide (D2O) metabole opname. Metabole opname van D2O in biomassa en de metabole activiteitsremming bij blootstelling aan antibiotica op het niveau van één bacterie worden gemonitord door SRS-beeldvorming. De single-cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) van bacteriën bij blootstelling aan antibiotica kan worden verkregen na een totaal van 2,5 uur monstervoorbereiding en -detectie. Bovendien is deze snelle AST-methode direct toepasbaar op bacteriële monsters in complexe biologische omgevingen, zoals urine of volbloed. SRS metabole beeldvorming van deuteriumincorporatie is transformerend voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Introduction

Antimicrobiële resistentie (AMR) is een groeiende wereldwijde bedreiging voor de effectieve behandeling van infectieziekten1. Er wordt voorspeld dat AMR tegen 2050 nog eens 10 miljoen doden per jaar en $ 100 biljoen wereldwijd bbp-verlies zal veroorzaken als er geen actie wordt ondernomen voor de bestrijding van antibioticaresistente bacteriën 1,2. Dit benadrukt de dringende behoefte aan snelle en innovatieve diagnostische methoden voor antibioticagevoeligheidstests (ASAT) van infectieuze bacteriën om de opkomst van antibioticaresistente bacteriën te vertragen en het gerelateerde sterftecijfer te verminderen3. Om het best mogelijke klinische resultaat te garanderen, is het cruciaal om binnen 24 uur effectieve therapie te introduceren. De huidige gouden standaardmethode, zoals schijfdiffusie of bouillonverdunningsmethode, vereist echter meestal ten minste 24 uur voor de pre-cubatieprocedure voor klinische monsters en een extra 16-24 uur om de resultaten van de minimale remmende concentratie (MIC) te verkrijgen. Over het algemeen zijn deze methoden te tijdrovend om een onmiddellijke beslissing voor infectieziektebehandeling in de kliniek te begeleiden, wat leidt tot het ontstaan en de verspreiding van antimicrobiële resistentie4.

Genotypische AST-methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde technieken5, zijn ontwikkeld voor snelle detectie. Dergelijke technieken meten de specifieke resistentie genetische sequenties om snelle AST-resultaten te verkrijgen. Ze zijn niet afhankelijk van tijdrovende celkweek; alleen specifieke bekende genetische sequenties met resistentie worden echter getest. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot verschillende bacteriesoorten of verschillende resistentiemechanismen. Ook kunnen ze geen MIC-resultaten leveren voor therapiebeslissingen 6,7. Bovendien zijn er nieuwe fenotypische methoden voor snelle ASAT in ontwikkeling om deze beperkingen te overwinnen8, waaronder microfluïdische apparaten 9,10,11,12,13, optische apparaten 14,15,16, fenotypische AST die de nucleïnezuren kwantificeert kopie nummer 17,18, en Raman spectroscopische methoden19, 20,21,22,23,24. Deze methoden verkorten de tijd om AST-resultaten te begeleiden, maar de meeste zijn alleen van toepassing op bacteriële isolaten, niet rechtstreeks op klinische monsters, en vereisen nog steeds langdurige pre-incubatie.

In dit werk presenteren we een methode voor snelle bepaling van de gevoeligheid van bacteriën in de urine en volbloed via monitoring van de cellulaire metabole activiteit door SRS-beeldvorming. Water (H2O) neemt deel aan de overgrote meerderheid van essentiële biomoleculaire syntheseprocessen in levende cellen. Als een isotopoloog van water, door middel van een enzymgekatalyseerde H/D-uitwisselingsreactie tussen het redox-actieve waterstofatoom in NADPH en het D-atoom in D2O, kan deuterium worden opgenomen in biomassa in een cel25,26. Een gedeutereerde vetzuursynthesereactie wordt gemedieerd door het deuterium gelabelde NADPH. De D2O-opname in reacties van aminozuren (AA’s) resulteert in de gedeutereerde eiwitproductie26 (figuur 1). Op deze manier kunnen de nieuw gesynthetiseerde C-D-bindingsbevattende biomoleculen in enkele microbiële cellen worden gebruikt als een algemene metabole activiteitsmarker die moet worden gedetecteerd. Om de novo gesynthetiseerde C-D-bindingen uit te lezen, wordt Raman-spectroscopie, een veelzijdig analytisch hulpmiddel dat specifieke en kwantitatieve chemische informatie over biomoleculen biedt, veel gebruikt om antimicrobiële gevoeligheid te bepalen en de testtijd aanzienlijk te verkorten tot een paar uur 27,28,29,30 . Vanwege de inherente lage efficiëntie van het Raman-verstrooiingsproces is de spontane Raman-spectroscopie echter van lage detectiegevoeligheid. Daarom is het een uitdaging om real-time beeldresultaten te verkrijgen met behulp van spontane Raman-spectroscopie. Coherente Raman-verstrooiing (CRS), inclusief coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS), heeft een hoge detectiegevoeligheid bereikt vanwege het coherente lichtveld om ordes van grootte te genereren die groter zijn dan die van spontane Raman-spectroscopie, waardoor snelle, specifieke en kwantitatieve chemische beeldvorming op het niveau van één cel 31,32,33,34,35 wordt weergegeven ,36,37,38,39.

Hier, op basis van ons meest recente werk40, presenteren we een protocol voor snelle bepaling van de metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid door femtoseconde SRS C-D beeldvorming van D2O opname van bacteriën in het normale medium, urine en volbloedomgeving op het niveau van één cel. Femtoseconde SRS-beeldvorming vergemakkelijkt het monitoren van de single cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) tegen antibiotica op het niveau van de enkele bacterie binnen 2,5 uur. De SC-MIC-resultaten worden gevalideerd door standaard MIC-test via bouillonmicroverdunning. Onze methode is toepasbaar voor het bepalen van antimicrobiële gevoeligheid van bacteriën urineweginfectie (UTI) en bloedbaaninfectie (BSI) pathogenen met een veel kortere testtijd in vergelijking met de conventionele methode, die de mogelijkheid opent voor snelle fenotypische AST in de kliniek op het niveau van één cel.

Protocol

Het gebruik van menselijke bloedmonsters is in overeenstemming met de richtlijnen van de IRB van Boston University en de National Institutes of Health (NIH). Concreet zijn de exemplaren afkomstig van een bank en zijn ze volledig gedeïdentificeerd. Deze exemplaren worden niet beschouwd als menselijke proefpersonen door het bureau van de Institutional Review Board (IRB) aan de Universiteit van Boston. 1. Bereiding van de voorraadoplossing voor bacteriën en antibiotica Bereid de antib…

Representative Results

Het effect van incubatietijd op de opname van deuterium wordt gemeten door spontane Raman-microspectroscopie in het C-D (2070 tot 2250 cm-1) en C-H (2.800 tot 3.100 cm-1) gebied (figuur 4a). De time-lapse eencellige Raman-spectra van P. aeruginosa gekweekt in 70% D2O met medium vertonen een toenemende CD / CH-intensiteit gedurende de incubatietijd van 0 tot 180 min. (Figuur 4b) De toenemende C-D-abundantie in enkele micr…

Discussion

Snelle ASAT kan worden verkregen door de respons van bacteriële metabole activiteit op antibioticabehandeling te beoordelen met behulp van eencellige SRS metabole beeldvorming binnen 2,5 uur van het monster tot SC-MIC-resultaten. De respons van bacteriële metabole activiteit en antimicrobiële gevoeligheid kan worden gedetecteerd door de metabole opname van D2O voor biomolecuulsynthese te monitoren met behulp van SRS-beeldvorming van C-D-bindingen. Omdat water alomtegenwoordig wordt gebruikt in levende celle…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH R01AI141439 naar J.-X.C en M.S, en R35GM136223 naar J.-X.C.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. O’Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. The review on Antimicrobial Resistance. , (2016).
  2. Sugden, R., Kelly, R., Davies, S. Combatting antimicrobial resistance globally. Nature Microbiology. 1 (10), 16187 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  4. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  5. Frickmann, H., Masanta, W. O., Zautner, A. E. Emerging rapid resistance testing methods for clinical microbiology laboratories and their potential impact on patient management. BioMed Research International. 2014, 375681 (2014).
  6. Avesar, J., et al. Rapid phenotypic antimicrobial susceptibility testing using nanoliter arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (29), 5787-5795 (2017).
  7. Schoepp, N. G., et al. Digital quantification of DNA replication and chromosome segregation enables determination of antimicrobial susceptibility after only 15 minutes of antibiotic exposure. Angewandte Chemie International Edition. 55 (33), 9557-9561 (2016).
  8. van Belkum, A., et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 299-311 (2020).
  9. Hou, Z., An, Y., Hjort, K., Sandegren, L., Wu, Z. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
  10. Choi, J., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing by tracking single cell growth in a microfluidic agarose channel system. Lab on a Chip. 13 (2), 280-287 (2013).
  11. Lu, Y., et al. Single cell antimicrobial susceptibility testing by confined microchannels and electrokinetic loading. Analytical Chemistry. 85 (8), 3971-3976 (2013).
  12. Kim, S. C., Cestellosblanco, S., Inoue, K., Zare, R. N. Miniaturized antimicrobial susceptibility test by combining concentration gradient generation and rapid cell culturing. Antibiotics. 4 (4), 455-466 (2015).
  13. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  14. Baltekin, &. #. 2. 1. 4. ;., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, D. I., Elf, J. Antibiotic susceptibility testing in less than 30 min using direct single-cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (34), 9170-9175 (2017).
  15. Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
  16. Choi, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Science Translational Medicine. 6 (267), (2014).
  17. Barczak, A. K., Hung, D. T. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  18. Schoepp, N. G., et al. Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples. Science Translational Medicine. 9 (410), (2017).
  19. Novelli-Rousseau, A., et al. Culture-free antibiotic-susceptibility determination from single-bacterium Raman spectra. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  20. Schröder, U. -. C., et al. Detection of vancomycin resistances in enterococci within 3 1/2 hours. Scientific Reports. 5, 8217 (2015).
  21. Liu, C. -. Y., et al. Rapid bacterial antibiotic susceptibility test based on simple surface-enhanced Raman spectroscopic biomarkers. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  22. Chang, K. -. W., et al. Antibiotic susceptibility test with surface-enhanced raman scattering in a microfluidic system. Analytical Chemistry. 91 (17), 10988-10995 (2019).
  23. Galvan, D. D., Yu, Q. surface-enhanced raman scattering for rapid detection and characterization of antibiotic-resistant bacteria. Advanced Healthcare Materials. 7 (13), 1701335 (2018).
  24. Kirchhoff, J., et al. Simple ciprofloxacin resistance test and determination of minimal inhibitory concentration within 2 h using raman spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (3), 1811-1818 (2018).
  25. Zhang, Z., Chen, L., Liu, L., Su, X., Rabinowitz, J. D. Chemical basis for deuterium labeling of fat and NADPH. Journal of the American Chemical Society. 139 (41), 14368-14371 (2017).
  26. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
  27. Berry, D., et al. Tracking heavy water (D2O) incorporation for identifying and sorting active microbial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 194-203 (2015).
  28. Tao, Y., et al. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled single-cell raman microspectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (7), 4108-4115 (2017).
  29. Yang, K., et al. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria using heavy water-labeled single-cell raman spectroscopy in clinical samples. Analytical Chemistry. 91 (9), 6296-6303 (2019).
  30. Song, Y., et al. Raman-Deuterium Isotope Probing for in-situ identification of antimicrobial resistant bacteria in Thames River. Scientific reports. 7 (1), 16648 (2017).
  31. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  32. Cheng, J. -. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  33. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 415-445 (2015).
  34. Yue, S., Cheng, J. -. X. Deciphering single cell metabolism by coherent Raman scattering microscopy. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 46-57 (2016).
  35. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  36. Ji, M., et al. Rapid, Label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  37. He, R., Liu, Z., Xu, Y., Huang, W., Ma, H., Ji, M. Stimulated Raman scattering microscopy and spectroscopy with a rapid scanning optical delay line. Optics Letters. 42 (4), 659-662 (2017).
  38. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  39. Camp, C. H., et al. High-Speed Coherent Raman Fingerprint Imaging of Biological Tissues. Nature Photonics. 8, 627-634 (2014).
  40. Zhang, M., et al. Rapid determination of antimicrobial susceptibility by stimulated raman scattering imaging of D2O metabolic incorporation in a single bacterium. Advanced Science. 7 (19), 2001452 (2020).
  41. Michael, I., et al. A fidget spinner for the point-of-care diagnosis of urinary tract infection. Nature Biomedical Engineering. 4 (6), 591-600 (2020).
  42. Bhattacharyya, R. P., et al. Simultaneous detection of genotype and phenotype enables rapid and accurate antibiotic susceptibility determination. Nature Medicine. 25 (12), 1858-1864 (2019).
  43. Stupar, P., et al. Nanomechanical sensor applied to blood culture pellets: a fast approach to determine the antibiotic susceptibility against agents of bloodstream infections. Clinical Microbiology and Infection. 23 (6), 400-405 (2017).
  44. Barber, A. E., Norton, J. P., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
  45. Cohen, J., et al. Sepsis: a roadmap for future research. The Lancet Infectious Diseases. 15 (5), 581-614 (2015).
  46. Choi, J., et al. rapid antimicrobial susceptibility test from positive blood cultures based on microscopic imaging analysis. Scientific Reports. 7 (1), 1148 (2017).
  47. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 72 (1), 20-31 (2012).
  48. Machen, A., Drake, T., Wang, Y. F. Same day identification and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysis-filtration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system. Plos One. 9, 87870 (2014).
  49. Simon, L., et al. Direct identification of 80 percent of bacteria from blood culture bottles by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry using a 10-minute extraction protocol. Journal of Clinical Microbiology. 57 (2), 01278 (2019).
  50. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  51. Johnson, L., et al. Emergence of fluoroquinolone resistance in outpatient urinary Escherichia coli isolates. The American Journal of Medicine. 121 (10), 876-884 (2008).
  52. Van Belkum, A., et al. Developmental roadmap for antimicrobial susceptibility testing systems. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 51-62 (2019).
  53. Dubourg, G., Lamy, B., Ruimy, R. Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections: meeting the challenge to reduce the time to result. Clinical Microbiology and Infection. 24 (9), 935-943 (2018).

Tags

Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
check_url/pt/62398?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image