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Biologia

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

Published: February 14, 2022
doi:
10.3791/62398
, ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Boston University, 2Boston University Photonics Center,Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering,Boston University, 5Department of Chemistry,Boston University

Summary

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Abstract

Um die Ausbreitung antimikrobiell resistenter Infektionen zu verlangsamen und zu verhindern, ist es dringend erforderlich, die antimikrobiellen Wirkungen auf Krankheitserreger quantitativ zu bestimmen. Es dauert in der Regel Tage, um die AST mit herkömmlichen Methoden abzuschließen, die auf der Langzeitkultur basieren, und sie funktionieren nicht direkt für klinische Proben. Hier berichten wir über eine schnelle AST-Methode, die durch stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Bildgebung der Deuteriumoxid (D2O) metabolischen Inkorporation ermöglicht wird. Der metabolische Einbau vonD2Oin Biomasse und die Hemmung der Stoffwechselaktivität bei Exposition gegenüber Antibiotika auf Einzelbakterienebene werden durch SRS-Bildgebung überwacht. Die Einzelzellstoffwechsel-Inaktivierungskonzentration (SC-MIC) von Bakterien bei Exposition gegenüber Antibiotika kann nach insgesamt 2,5 Stunden Probenvorbereitung und -nachweis ermittelt werden. Darüber hinaus ist diese schnelle AST-Methode direkt auf Bakterienproben in komplexen biologischen Umgebungen wie Urin oder Vollblut anwendbar. Die SRS-metabolische Bildgebung der Deuteriuminkorporation ist transformativ für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik.

Introduction

Antimikrobielle Resistenz (AMR) ist eine wachsende globale Bedrohung für die wirksame Behandlung von Infektionskrankheiten1. Es wird prognostiziert, dass AMR bis 2050 zusätzliche 10 Millionen Todesfälle pro Jahr und einen globalen BIP-Verlust von 100 Billionen US-Dollar verursachen wird, wenn keine Maßnahmen zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien ergriffen werden 1,2. Dies unterstreicht die dringende Notwendigkeit schneller und innovativer Diagnosemethoden für Antibiotika-Empfindlichkeitstests (AST) von infektiösen Bakterien, um das Auftreten antibiotikaresistenter Bakterien zu verlangsamen und die damit verbundene Sterblichkeitsrate zu senken3. Um das bestmögliche klinische Ergebnis zu gewährleisten, ist es entscheidend, innerhalb von 24 Stunden eine wirksame Therapie einzuleiten. Die aktuelle Goldstandardmethode, wie die Scheibendiffusions- oder Brüheverdünnungsmethode, erfordert jedoch in der Regel mindestens 24 Stunden für das Vorinkubationsverfahren für klinische Proben und zusätzliche 16-24 Stunden, um die Ergebnisse der minimalen Hemmkonzentration (MIC) zu erhalten. Insgesamt sind diese Methoden zu zeitaufwendig, um eine sofortige Entscheidung für die Behandlung von Infektionskrankheiten in der Klinik zu treffen, was zur Entstehung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen führt4.

Genotypische AST-Methoden, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Techniken5, wurden für den schnellen Nachweis entwickelt. Solche Techniken messen die spezifischen Resistenz-Gensequenzen, um schnelle AST-Ergebnisse zu liefern. Sie sind nicht auf zeitaufwändige Zellkulturen angewiesen; Es werden jedoch nur bestimmte bekannte genetische Sequenzen mit Resistenz getestet. Daher ist seine Anwendung auf verschiedene Bakterienarten oder unterschiedliche Resistenzmechanismen beschränkt. Sie können auch keine MIC-Ergebnisse für Therapieentscheidungen liefern 6,7. Darüber hinaus werden neuartige phänotypische Methoden für schnelle AST entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden8, einschließlich mikrofluidischer Geräte 9,10,11,12,13, optischer Geräte14,15,16, phänotypischer AST zur Quantifizierung der Nukleinsäure-Kopienzahl17,18 und Raman-spektroskopischer Methoden 19. 20,21,22,23,24. Diese Methoden verkürzen die Zeit, um AST-Ergebnisse zu steuern, aber die meisten von ihnen sind nur auf Bakterienisolate anwendbar, nicht direkt auf klinische Proben, und erfordern immer noch eine lange Vorinkubation.

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur schnellen Bestimmung der Empfindlichkeit von Bakterien im Urin und Vollblut durch Überwachung der zellulären Stoffwechselaktivität mittels SRS-Bildgebung vor. Wasser (H2O) ist an der überwiegenden Mehrheit der wesentlichen biomolekularen Syntheseprozesse in lebenden Zellen beteiligt. Als Isotopologe von Wasser kann Deuterium durch enzymkatalysierte H/D-Austauschreaktion zwischen dem redoxaktiven Wasserstoffatom in NADPH und demD-Atom in D2Oin Biomasse innerhalb einer Zelle25,26 eingebaut werden. Eine deuterierte Fettsäuresynthesereaktion wird durch das mit Deuterium markierte NADPH vermittelt. DerD2O-Einbauin Reaktionen von Aminosäuren (AAs) führt zur deuterierten Proteinproduktion26 (Abbildung 1). Auf diese Weise können die neu synthetisierten C-D-Bindungs-haltigen Biomoleküle in einzelnen mikrobiellen Zellen als allgemeiner metabolischer Aktivitätsmarker verwendet werden, um nachgewiesen zu werden. Um de novo synthetisierte C-D-Bindungen auszulesen, wird die Raman-Spektroskopie, ein vielseitiges Analysewerkzeug, das spezifische und quantitative chemische Informationen über Biomoleküle liefert, häufig verwendet, um die antimikrobielle Empfindlichkeit zu bestimmen und die Testzeit auf wenige Stunden deutlich zu reduzieren27,28,29,30 . Aufgrund der inhärenten geringen Effizienz des Raman-Streuprozesses ist die spontane Raman-Spektroskopie jedoch von geringer Detektionsempfindlichkeit. Daher ist es schwierig, Echtzeit-Bildergebnisse mittels spontaner Raman-Spektroskopie zu erhalten. Die kohärente Raman-Streuung (CRS), einschließlich der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und der stimulierten Raman-Streuung (SRS), hat aufgrund des kohärenten Lichtfeldes eine hohe Detektionsempfindlichkeit erreicht, die um Größenordnungen größer ist als die spontane Raman-Spektroskopie, wodurch eine schnelle, spezifische und quantitative chemische Bildgebung auf Einzelzellebene ermöglichtwird 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Hier, basierend auf unserer jüngsten Arbeit40, präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen Bestimmung der metabolischen Aktivität und antimikrobiellen Suszeptibilität durch Femtosekunden-SRS-C-D-Bildgebung vonD2O-Einbauvon Bakterien in das normale Medium, Urin und Vollblutumgebung auf Einzelzellebene. Die Femtosekunden-SRS-Bildgebung ermöglicht die Überwachung der Inaktivierungskonzentration des Einzelzellstoffwechsels (SC-MIC) gegen Antibiotika auf Einzelbakteriumebene innerhalb von 2,5 h. Die SC-MIC-Ergebnisse werden durch Standard-MIC-Test mittels Brühe-Mikrodilution validiert. Unsere Methode ist anwendbar zur Bestimmung der antimikrobiellen Anfälligkeit von bakteriellen Harnwegsinfektionen (UTI) und Blutbahninfektionen (BSI) Erregern mit einer viel kürzeren Assay-Zeit im Vergleich zur konventionellen Methode, was die Möglichkeit für eine schnelle phänotypische AST in der Klinik auf Einzelzellebene eröffnet.

Protocol

Die Verwendung von menschlichen Blutproben erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IRB der Boston University und der National Institutes of Health (NIH). Konkret stammen die Exemplare aus einer Bank und sind vollständig deidentifiziert. Diese Exemplare werden vom Büro des Institutional Review Board (IRB) an der Boston University nicht als menschliche Subjekte betrachtet. 1. Herstellung von Bakterien- und Antibiotika-Stammlösung Die Antibiotika-Stammlösung (Gentamicins…

Representative Results

Der Effekt der Inkubationszeit auf den Deuteriumeinbau wird durch spontane Raman-Mikrospektroskopie im Bereich C-D (2070 bis 2250 cm-1) und C-H (2.800 bis 3.100 cm-1) gemessen (Abbildung 4a). Die Einzelzell-Raman-Spektren von P. aeruginosa, die in 70O-haltigemMedium kultiviert wurden, zeigen eine zunehmende CD/CH-Intensität über die Inkubationszeit von 0 bis 180 min. (Abbildung 4b) Die zunehmende C-D-Häufigkeit in …

Discussion

Eine schnelle AST kann durch die Beurteilung der Reaktion der bakteriellen Stoffwechselaktivität auf die Antibiotikabehandlung unter Verwendung von Einzelzell-SRS-Stoffwechselbildgebung innerhalb von 2,5 Stunden von der Probe bis zu SC-MIC-Ergebnissen erreicht werden. Die Reaktion der bakteriellen Stoffwechselaktivität und der antimikrobiellen Empfindlichkeit kann durch Überwachung des metabolischen Einbaus vonD2Ofür die Biomolekülsynthese unter Verwendung der SRS-Bildgebung von C-D-Bindungen nachgewiesen…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeiten wurden von NIH R01AI141439 bis J.-X.C und M.S und R35GM136223 bis J.-X.C.

Materials

Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2
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Keywords: Rapid Antimicrobial Susceptibility TestingStimulated Raman ScatteringDeuterium IncorporationSingle BacteriumBacterial ConcentrationOptical DensityColony Forming UnitsAntibioticMHB MediumSerial DilutionPositive ControlNegative ControlIncubationHomogenization
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).
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