Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Summary

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D₂O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Abstract

Para retardar e prevenir a propagação de infecções resistentes a antimicrobianos, o teste rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) é urgente para determinar quantitativamente os efeitos antimicrobianos sobre os patógenos. Normalmente, leva dias para completar o AST por métodos convencionais baseados na cultura de longo prazo, e eles não funcionam diretamente para amostras clínicas. Aqui, relatamos um método AST rápido possibilitado por imagens estimuladas de espalhamento Raman (SRS) da incorporação metabólica de óxido de deutério (D₂O). A incorporação metabólica de D₂O na biomassa e a inibição da atividade metabólica após a exposição a antibióticos no nível de uma única bactéria são monitoradas por imagens SRS. A concentração de inativação do metabolismo unicelular (SC-MIC) de bactérias após a exposição a antibióticos pode ser obtida após um total de 2,5 h de preparação e detecção da amostra. Além disso, este método AST rápido é diretamente aplicável a amostras bacterianas em ambientes biológicos complexos, como urina ou sangue total. A imagem metabólica SRS da incorporação de deutério é transformadora para AST fenotípica rápida de célula única na clínica.

Introduction

A resistência antimicrobiana (RAM) é uma ameaça global crescente ao tratamento eficaz de doenças infecciosas¹. Prevê-se que a RAM causará mais 10 milhões de mortes por ano e uma perda de PIB global de US $ 100 trilhões até 2050 se nenhuma ação para combater bactérias resistentes a antibióticos for tomada ^1,2. Isso enfatiza a necessidade urgente de métodos diagnósticos rápidos e inovadores para o teste de suscetibilidade a antibióticos (AST) de bactérias infecciosas para retardar o surgimento de bactérias resistentes a antibióticos e reduzir a taxa de mortalidade relacionada³. Para garantir o melhor resultado clínico possível, é crucial introduzir uma terapia eficaz dentro de 24 horas. No entanto, o método padrão-ouro atual, como o método de difusão em disco ou diluição em caldo, geralmente requer pelo menos 24 h para o procedimento de pré-incubação para amostras clínicas e um adicional de 16-24 h para obter os resultados da concentração inibitória mínima (CIM). No geral, esses métodos são muito demorados para orientar uma decisão imediata para o tratamento de doenças infecciosas na clínica, o que leva ao surgimento e disseminação da resistência antimicrobiana⁴.

Métodos genotípicos de AST, como técnicas baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR)⁵, foram desenvolvidos para detecção rápida. Tais técnicas medem as sequências genéticas de resistência específicas, a fim de fornecer resultados rápidos de AST. Eles não dependem de cultura celular demorada; no entanto, apenas sequências genéticas específicas conhecidas com resistência são testadas. Portanto, sua aplicação é limitada a várias espécies bacterianas ou diferentes mecanismos de resistência. Além disso, não podem fornecer resultados de CIM para as decisões terapêuticas ^6,7. Além disso, novos métodos fenotípicos para AST rápida estão em desenvolvimento para superar essas limitações⁸, incluindo dispositivos microfluídicos 9,10,11,12,13, dispositivos ópticos^14,15,16, AST fenotípicos quantificando a cópia de ácidos nucleicos número ^17,18 e métodos espectroscópicos Raman ^19, 20,21,22,23,24. Esses métodos reduzem o tempo para orientar os resultados da AST, no entanto, a maioria deles só é aplicável a isolados bacterianos, não diretamente a espécimes clínicos, e ainda requer pré-incubação de longo prazo.

Neste trabalho, apresentamos um método para determinação rápida da suscetibilidade de bactérias na urina e no sangue total via monitoramento da atividade metabólica celular por meio de imagens SRS. A água (H₂O) participa na grande maioria dos processos essenciais de síntese biomolecular em células vivas. Como um isotólogo da água, através da reação de troca H/D catalisada por enzimas entre o átomo de hidrogênio redox-ativo no NADPH e o átomo D em D₂O, o deutério pode ser incorporado à biomassa dentro de uma célula^25,26. Uma reação de síntese de ácidos graxos deuterados é mediada pelo deutério marcado NADPH. A incorporação de D₂O em reações de aminoácidos (AAs) resulta na produção de proteína deuterada²⁶ (Figura 1). Desta forma, as biomoléculas contendo ligações C-D recém-sintetizadas em células microbianas únicas podem ser empregadas como um marcador geral de atividade metabólica a ser detectado. Para ler ligações C-D sintetizadas de novo, a espectroscopia Raman, uma ferramenta analítica versátil que fornece informações químicas específicas e quantitativas de biomoléculas, é amplamente utilizada para determinar a suscetibilidade antimicrobiana e reduzir significativamente o tempo de teste para algumas horas^27,28,29,30 . No entanto, devido à baixa eficiência inerente do processo de espalhamento Raman, a espectroscopia Raman espontânea é de baixa sensibilidade de detecção. Portanto, é um desafio obter resultados de imagem em tempo real usando espectroscopia Raman espontânea. O espalhamento Raman coerente (SRS), incluindo o espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS) e o espalhamento Raman estimulado (SRS), atingiu alta sensibilidade de detecção devido ao campo de luz coerente para gerar ordens de magnitude maiores do que a da espectroscopia Raman espontânea, tornando assim imagens químicas de alta velocidade, específicas e quantitativas no nível de célula única 31,32,33,34,35 ,^36,37,38,39.

Aqui, com base em nosso trabalho mais recente⁴⁰, apresentamos um protocolo para determinação rápida da atividade metabólica e suscetibilidade antimicrobiana por imagem C-D SRS de femtossegundos da incorporação de bactérias D₂O no meio normal, urina e ambiente sanguíneo total no nível unicelular. A imagem SRS de femtossegundos facilita o monitoramento da concentração de inativação do metabolismo de célula única (SC-MIC) contra antibióticos no nível de bactéria única dentro de 2,5 h. Os resultados do SC-MIC são validados pelo teste MIC padrão via microdiluição em caldo. Nosso método é aplicável para determinar a suscetibilidade antimicrobiana de bactérias patogênicas de infecção do trato urinário (ITU) e infecção da corrente sanguínea (BSI) com um tempo de ensaio muito reduzido em comparação com o método convencional, o que abre a oportunidade para AST fenotípica rápida na clínica no nível de célula única.

Protocol

O uso de amostras de sangue humano está de acordo com as diretrizes do IRB da Universidade de Boston e dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Especificamente, os espécimes são de um banco e são completamente desidentificados. Esses espécimes não são considerados seres humanos pelo escritório do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Boston. 1. Preparação de bactérias e solução de estoque de antibióticos Preparar a solução-mãe de antibióticos …

Representative Results

O efeito do tempo de incubação na incorporação de deutério é medido por microespectroscopia Raman espontânea nas regiões C-D (2070 a 2250 cm-1) e C-H (2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Os espectros Raman unicelulares de lapso de tempo de P. aeruginosa cultivados em meio contendo 70% de D 2 O mostram aumento da intensidade de CD/CH ao longo do tempo de incubação de 0 a 180 min. (Figura 4b) O aumento da abundância de C-D em…

Discussion

A AST rápida pode ser obtida avaliando a resposta da atividade metabólica bacteriana ao tratamento com antibióticos usando imagens metabólicas SRS de célula única dentro de 2,5 h da amostra para os resultados da SC-MIC. A resposta da atividade metabólica bacteriana e a suscetibilidade antimicrobiana podem ser detectadas pelo monitoramento da incorporação metabólica de D₂O para síntese de biomoléculas usando imagens SRS de ligações C-D. Como a água é usada de forma onipresente em células vivas,…

Materials

Acousto-optic modulation	Gooch&Housego	R15180-1.06-LTD	Modulating stokes laser beam
Amoxicillin	Sigma Aldrich	A8523-5G
Bandpass filter	Chroma	HQ825/150m	Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016-100G	Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth	Fisher Scientific	B12322	Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge	Thermo Scientific	75002542
Cover Glasses	VWR	16004-318
Culture tube with snap cap	Fisher brand	149569B
Daptomycin	Acros	A0386346
Deuterium oxide		151882	Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6	Sigma Aldrich	156914	Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113	The Coli Genetic Stock Center	7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher brand	05-408-129
Gentamicin sulfate	Sigma Aldrich	G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters	Millipore-Sigma	SLSV025NB	pore size 5 µm
ImageJ software	NIH	Version: 2.0.0-rc-69/1.52t	Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C	VWR	97009-890
Inoculation loop	Sigma	BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser	Spectra-Physics	Model: insight X3	Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI	Demodulate the SRS signals
Oil condenser	Olympus	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)	American Type Culture Collection	ATCC 47085
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01	Detector
Polypropylene conical tube 15 mL	Falcon	14-959-53A
Polypropylene filters	Thermo Scientific	726-2520	pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes	Corning	07-202-031
Syringe 10 mL	Fisher brand	14955459
UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter	Model: DU 530	Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer	VWR	97043-562
Water objective	Olympus	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2