在 NAFLD/NASH 的鼠模型中应用超声波和剪切波弹性成像

Summary

本协议描述了使用增强的超声波技术来无侵入性地观察和量化非酒精性脂肪肝病啮齿动物模型中的肝脏组织变化。

Abstract

非酒精性脂肪性肝炎 （NASH） 是非酒精性脂肪肝病 （NAFLD） 谱系内的一种疾病，其特征是肝脂肪积累（脂肪积累）和炎症导致纤维化。临床前模型密切回顾人类NASH/NAFLD在药物开发中至关重要。虽然肝脏活检是目前测量 NAFLD/NASH 进展和诊断在临床上的黄金标准，但在临床前空间，在研究期间需要在多个时间点收集整个肝脏样本，或者需要肝脏活检进行组理分析来评估疾病阶段。

进行肝脏活检中期研究是一种侵入性和劳动密集型程序，收集肝脏样本以评估疾病水平会增加研究所需的研究动物数量。因此，需要一个可靠、可翻译、非侵入性的成像生物标志物来检测这些临床前模型中的 NASH/NAFLD。非侵入性超声波B模式图像和剪切波弹性扫描（SWE）可用于测量硬化和肝纤维化。为了评估SWE在NASH临床前啮齿动物模型中的效用，动物被置于支持NASH的饮食中，并进行了非侵入性超声B模式和剪切波弹性成像，以测量肝体（HR）指数和肝脏弹性，分别测量肝脏脂肪积累和组织僵硬的进展，在给定的NAFLD/NASH研究过程中的多个时间点。

人力资源指数和弹性数字与硬化和纤维化的组织学标记进行了比较。结果显示，HR指数与油红O（ORO）染色百分比之间以及肝脏的弹性和皮克罗-天狼星红（PSR）染色之间有很强的相关性。经典 前体内 方法与 体内 成像结果之间的强相关性提供了证据，证明剪切波弹性成像/超声波成像可用于评估 NAFLD/NASH 临床前模型中的疾病表型和进展。

Introduction

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一种代谢性疾病，其特征是肝脏中脂肪的过度积累，并迅速成为全球领先的肝病，最近报告的全球流行率为^25%。非酒精性脂肪炎 （NASH） 是 NAFLD 谱中进展较广的阶段，其特点是肝脂肪过多，细胞损伤、炎症和纤维化。这些疾病通常是沉默的，通过血液检查或常规检查没有被发现，直到病人的肝脏已经发生了相当大的损害。目前，患者诊断NASH的黄金标准是通过对患者肝脏活检样本的病理检查。同样，致力于了解NASH/NAFLD以及药物开发行业的临床前研究人员依靠肝脏样本的 活楔 活检或卫星组群的末期安乐死来测量病变、炎症和纤维化。

例如，肝楔活检一直是评估肌热和纤维化的标准技术，同时使用GUBRA NASH模型^2。肝楔活检方法在^小动物中具有侵入性和艰辛性。在研究中使用楔形肝脏活检代表了疾病模型中一个额外的实验变量，这通常会增加需要的动物数量。考虑到这些因素，可用于可靠评估NASH/NAFLD动物模型早期点的硬化和纤维化的非侵入性成像技术被证明是有价值的。剪切波弹性学 （SWE） 是一种基于超声波的方法，用于测量软组织的弹性。该技术测量超声波超声波对组织目标产生的剪切波的传播，然后计算一个称为E模态⁴的值。剪切波的速度与组织僵硬程度成正比。

图 1 和 图 2 显示成像区域设置和 SWE 仪器。SWE 仪器是一个单轮单元，配有两个屏幕和图 2A中显示的控制面板。上部监视器 （图 2B）充当计算机监视器，显示图像和患者目录。控制面板 （图 2C）是一系列按钮和表盘，可控制图像捕获的一般方面：冻结屏幕、保存图像、从一种模式更改为另一种模式。下屏幕 （图 2D） 是一个触摸屏，具有额外的控制来更改设置，并充当键盘，根据需要输入数据。如果需要，仪器配有手写笔，可在触摸屏上使用。超声波探头连接到设备的下前面板。对于啮齿动物的B模式和SWE成像，使用了超线性6至20兆赫传感器。这种非侵入性测量组织刚度的能力使SWE成为在NASH患者中识别和分期进行肝纤维化⁵ 的宝贵工具，减少了对更具侵入性的方法的需求。事实上，SWE已经用于测量患者的肝纤维化，是FDA批准的方法，在诊所⁶分纤维化评分。使用SWE监测该疾病动物模型中的NASH进展，将为治疗的发展提供一个转化工具，同时通过减少动物受试人数和改进 体内 程序来改善动物福利，以尽量减少疼痛和痛苦。

SWE成像在人类患者中使用低频超声波传感器^4，这是不理想的小动物。值得注意的是，高频SWE技术被用来评估乙酰-CoA卡盒酶抑制在大鼠^模型7中对NASH发病机制的疗效，该技术的实用性在肝纤维化碳四氯化物大鼠模型中得到了描述，与传统的METAVIR组理评分方法⁸相比，取得了成功的结果。然而，现有的文献缺乏关于SWE成像在NASH临床前模型中应用的详细技术和方法信息。如上所述，肝硬化是 NAFLD/NASH 状况的主要特征之一，也是考虑干预的重要阶段。因此，使用成像方式评估肝脂肪积累与在 NASH/NAFLD 临床前模型中评估肝纤维化同样重要。

一种被称为HR指数的超声波技术，肝脏组织亮度与肾皮质的比例，已被用作^9、10临床上硬化的代名词。然而，这种方法尚未在NAFLD/NASH的临床前动物模型中广泛使用。本文描述了一种测量弹性的方法以及HR指数作为肝纤维化和硬化的代名指标，分别在低血脂缺乏，高脂肪饮食（CDAHFD）大鼠模型的NAFLD/NASH。该模型诱发快速硬化，肝炎症和纤维化，这是可测量在6周内在小鼠^11。这种饮食中胆固醇的添加（1%）已被证明可以促进大鼠¹²的纤维生成，使该模型成为涉及剪切波成像的验证研究的合适候选者。总的来说，这种成像技术也可以应用于各种NASH模型/饮食，其中硬化和/或纤维化是感兴趣的终点。

Protocol

所有涉及动物的程序都经过辉瑞机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的审查和批准，并在 AAALAC（实验室动物护理评估和认证）国际认可机构中进行。 1. 疾病诱导 使用雄性威斯特汉鼠（150-175克;+6-7周大;总共40只大鼠），这些大鼠没有已知的大鼠来临病原体。将大鼠与纸质床上用品单独通风（参见 材料表）成对存放，并将它们保持在 22 ± 1 °C，相对湿度为 …

Representative Results

喂养 CDAHFD 的动物的一个标志是硬化。肝脏中脂肪的积累改变了组织的回波特性，通过测量肝脏的亮度并使其从同一平面拍摄的B模式图像正常化为肾皮质的亮度，可以量化组织。量化值表示为人力资源指数，这是一种间接的硬化度测量。在 图4A中，来自对照动物的代表性肝脏图像显示与肾脏皮层相比，亮度（回声原性）大致相同或更低。因此，正常动物的HR指数为<1。在这项…

Discussion

超声波成像，包括SWE，可以成为在NAFLD/NASH临床前模型中纵向评估肝硬化和僵硬的宝贵工具。本文描述了如何获得高质量的B模式以及SWE肝脏图像的详细方法，以便使用CDAHFD饮食诱导的NASH大鼠模型测量HR指数和弹性。此外，结果表明，人力资源指标与弹性与肝组织评价组织评价的黄金标准具有极高的相关性。虽然程序本身似乎不复杂，但协议的某些关键方面将确保成功的结果。

…

Materials

Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubricatn to prevent eye dryness  during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Wistar Han rats	Charles River Laboratories