Application de l’échographie et de l’imagerie par élastographie par ondes de cisaillement dans un modèle de rat de NAFLD / NASH
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’une technique d’échographie améliorée pour observer et quantifier de manière non invasive les changements tissulaires hépatiques dans les modèles de rongeurs de stéatose hépatique non alcoolique.
Abstract
La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est une affection du spectre de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), caractérisée par une accumulation de graisse hépatique (stéatose) et une inflammation conduisant à la fibrose. Les modèles précliniques récapitulant étroitement la NASH humaine / NAFLD sont essentiels au développement de médicaments. Alors que la biopsie du foie est actuellement la norme d’or pour mesurer la progression et le diagnostic de la NAFLD / NASH en clinique, dans l’espace préclinique, la collecte d’échantillons de foie entier à plusieurs moments au cours d’une étude ou la biopsie du foie est nécessaire pour l’analyse histologique afin d’évaluer le stade de la maladie.
La réalisation d’une biopsie du foie à mi-parcours est une procédure invasive et exigeante en main-d’œuvre, et la collecte d’échantillons de foie pour évaluer le niveau de la maladie augmente le nombre d’animaux de recherche nécessaires à une étude. Ainsi, il est nécessaire de mettre en avant un biomarqueur d’imagerie fiable, traduisible et non invasif pour détecter la NASH/NAFLD dans ces modèles précliniques. Les images non invasives en mode B basées sur l’échographie et l’élastographie par ondes de cisaillement (SWE) peuvent être utilisées pour mesurer la stéatose ainsi que la fibrose hépatique. Pour évaluer l’utilité de la SWE dans les modèles précliniques de RONGEURs de la NASH, les animaux ont été soumis à un régime pro-NASH et ont subi une échographie non invasive en mode B et une imagerie par élastographie par ondes de cisaillement pour mesurer l’indice hépatorénal (HR) et l’élasticité du foie, mesurant la progression de l’accumulation de graisse hépatique et de la rigidité tissulaire, respectivement, à plusieurs moments au cours d’une étude NAFLD / NASH donnée.
L’indice HR et les chiffres d’élasticité ont été comparés aux marqueurs histologiques de la stéatose et de la fibrose. Les résultats ont montré une forte corrélation entre l’indice HR et le pourcentage de coloration à l’huile rouge O (ORO), ainsi qu’entre l’élasticité et la coloration du foie par picro-Sirius Red (PSR). La forte corrélation entre les méthodes ex vivo classiques et les résultats de l’imagerie in vivo fournit des preuves que l’élastographie par ondes de cisaillement / imagerie par ultrasons peut être utilisée pour évaluer le phénotype et la progression de la maladie dans un modèle préclinique de NAFLD / NASH.
Introduction
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une affection métabolique caractérisée par une accumulation excessive de graisse dans le foie et devient rapidement une maladie hépatique de premier plan dans le monde avec une prévalence mondiale récemment signalée de 25%1. La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est un stade plus avancé du spectre de la NAFLD, caractérisé par un excès de graisse hépatique avec des dommages cellulaires progressifs, une inflammation et une fibrose. Ces affections sont souvent silencieuses, non détectées par des tests sanguins ou des examens de routine, jusqu’à ce que des dommages considérables soient déjà survenus au foie d’un patient. Actuellement, l’étalon-or pour diagnostiquer la NASH chez les patients est l’examen histologique d’échantillons de biopsie hépatique dérivés du patient. De même, les chercheurs précliniques qui travaillent à comprendre la pathogenèse de la NASH / NAFLD ainsi que l’industrie du développement de médicaments s’appuient sur la biopsie en coin in vivo d’échantillons de foie ou l’euthanasie terminale de cohortes satellites pour l’histologie afin de mesurer la stéatose, l’inflammation et la fibrose.
Par exemple, la biopsie en coin hépatique a été une technique standard pour évaluer la stéatohépatite et la fibrose lors de l’utilisation du modèle GUBRA NASH2. La méthode de biopsie en coin du foie est invasive et laborieuse chez les petits animaux3. L’utilisation de la biopsie du foie en coin au milieu d’une étude représente une variable expérimentale supplémentaire dans un modèle de maladie, ce qui augmente souvent le nombre d’animaux nécessaires. Compte tenu de ces facteurs, les techniques d’imagerie non invasives qui peuvent être utilisées pour évaluer de manière fiable la stéatose et la fibrose dans les modèles animaux NASH / NAFLD à des moments précoces s’avèrent précieuses. L’élastographie par ondes de cisaillement (SWE) est une méthode à base d’ultrasons utilisée pour mesurer l’élasticité des tissus mous. La technique mesure la propagation des ondes de cisaillement créées par des impulsions ultrasonores supersoniques dirigées vers une cible tissulaire, puis calcule une valeur appelée module E4. La vitesse de l’onde de cisaillement est proportionnelle au degré de rigidité des tissus.
Les figures 1 et 2 montrent la configuration de la zone d’imagerie et l’instrument SWE. L’instrument SWE est une seule unité à roues avec deux écrans et un panneau de commande illustré à la figure 2A. Le moniteur supérieur(Figure 2B)agit comme l’écran de l’ordinateur et affiche les images et les répertoires des patients. Le panneau de commande (Figure 2C) est un ensemble de boutons et de cadrans qui contrôlent les aspects généraux de la capture d’image: gel de l’écran, enregistrement des images, passage d’un mode à un autre. L’écran inférieur(Figure 2D)est un écran tactile avec des commandes supplémentaires pour modifier les paramètres et agit comme un clavier pour saisir des données au besoin. L’instrument est équipé d’un stylet à utiliser sur l’écran tactile si vous le souhaitez. Les sondes à ultrasons se fixent au panneau avant inférieur de l’appareil. Pour l’imagerie en mode B et SWE chez les rongeurs, le transducteur super-linéaire de 6 à 20 MHz a été utilisé. Cette capacité à mesurer de manière non invasive la rigidité tissulaire fait de SWE un outil précieux pour l’identification et la stadification de la fibrose hépatique5 chez les patients NASH, réduisant ainsi le besoin de méthodes plus invasives. SWE a, en fait, été utilisé pour mesurer la fibrose hépatique chez les patients et est une méthode approuvée par la FDA pour noter la fibrose dans la clinique6. L’utilisation de SWE pour surveiller la progression de la NASH dans les modèles animaux de la maladie fournirait un outil translationnel pour le développement de traitements et améliorerait simultanément le bien-être des animaux grâce à la réduction du nombre de sujets animaux et au raffinement des procédures in vivo pour minimiser la douleur et la détresse.
L’imagerie SWE chez les patients humains utilise un transducteur à ultrasons basse fréquence4, ce qui n’est pas idéal pour les petits animaux. Notamment, des techniques SWE à haute fréquence ont été utilisées pour évaluer l’efficacité de l’inhibition de l’acétyl-CoA carboxylase sur la pathogenèse de la NASH dans un modèle de rat7,et l’utilité de cette technique a été décrite dans des modèles de fibrose hépatique de rat tétrachlorure de carbone avec des résultats positifs par rapport aux méthodes traditionnelles de notation histologique METAVIR8. Cependant, la littérature existante manque d’informations détaillées sur la technique et la méthodologie sur l’application de l’imagerie SWE dans les modèles précliniques de la NASH. Comme décrit ci-dessus, la stéatose hépatique est l’une des principales caractéristiques de la nafld / NASH et constitue une étape importante où une intervention peut être envisagée. Ainsi, l’évaluation de l’accumulation de graisse hépatique à l’aide d’une modalité d’imagerie est aussi importante que l’évaluation de la fibrose hépatique dans les modèles précliniques de NASH / NAFLD.
Une technique d’échographie connue sous le nom d’indice HR, un rapport de la luminosité tissulaire du foie par rapport à celle du cortex rénal, a été utilisée comme marqueur de substitution de la stéatose dans la clinique9,10. Cette approche, cependant, n’a pas été largement utilisée dans les modèles animaux précliniques de NAFLD/NASH. Cet article décrit une méthode de mesure de l’élasticité ainsi que l’indice HR en tant que marqueur de substitution de la fibrose hépatique et de la stéatose, respectivement, dans un modèle de rat NAFLD / NASH déficient en choline et riche en graisses (CDAHFD). Ce modèle induit une stéatose rapide, une inflammation du foie et une fibrose, ce qui est mesurable dans les 6 semaines chez la souris11. Il a été démontré que l’ajout de cholestérol (1%) à ce régime favorise la fibrogenèse chez le rat12,faisant de ce modèle un candidat approprié pour les études de validation impliquant l’imagerie par ondes de cisaillement. Dans l’ensemble, cette technologie d’imagerie peut également être appliquée à un large éventail de modèles / régimes NASH où la stéatose et / ou la fibrose est un critère d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie par ultrasons, y compris SWE, peut être un outil inestimable pour l’évaluation longitudinale de la stéatose et de la rigidité du foie dans les modèles précliniques de NAFLD / NASH. Cet article décrit des méthodologies détaillées sur la façon d’acquérir le mode B de haute qualité ainsi que des images SWE du foie pour la mesure de l’indice HR et de l’élasticité à l’aide d’un modèle de NASH induit par le régime CDAHFD. En outre, les résultats montrent une excellente corrélation d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier l’équipe des opérations de médecine comparative de Pfizer pour son travail acharné en prenant soin et en assurant la santé des animaux de l’étude, ainsi que pour son aide avec certaines des techniques. Nous remercions également Danielle Crowell, Gary Seitis et Jennifer Ashley Olson pour leur aide dans le traitement des tissus pour les analyses histologiques. En outre, les auteurs tiennent à remercier Julita Ramirez d’avoir examiné et fourni des commentaires précieux lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
Referências
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