יישום של אולטראסאונד ו גל גזה אלסטוגרפיה הדמיה במודל חולדה של NAFLD / NASH
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטכניקת אולטרסאונד משופרת כדי לבחון ולכומת באופן לא פולשני שינויים ברקמת הכבד במודלים מכרסמים של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי.
Abstract
Steatohepatitis nonalcoholic (NASH) הוא מצב בתוך הספקטרום של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), המאופיינת על ידי הצטברות שומן בכבד (steatosis) ודלקת המובילה פיברוזיס. מודלים פרה-קליניים מקרוב recapitulating אדם NASH / NAFLD חיוניים בפיתוח תרופות. בעוד ביופסיה בכבד היא כיום תקן הזהב למדידת התקדמות ואבחון NAFLD / NASH במרפאה, במרחב פרה קליני, או אוסף של דגימות כבד שלם בנקודות זמן מרובות במהלך מחקר או ביופסיה של הכבד נדרש לניתוח היסטולוגי כדי להעריך את שלב המחלה.
ביצוע ביופסיה בכבד באמצע המחקר הוא הליך פולשני ואינטנסיבי, ואיסוף דגימות כבד להערכת רמת המחלה מגדיל את מספר חיות המחקר הדרושות למחקר. לכן, יש צורך אמין, מתורגם, סמן ביולוגי הדמיה פולשנית כדי לזהות NASH / NAFLD במודלים פרה-אקליניים אלה. תמונות לא פולשניות מבוססות אולטרסאונד B-מצב ואלסטוגרפיה גל גחל גחל (SWE) ניתן להשתמש כדי למדוד סטאטוזיס, כמו גם פיברוזיס בכבד. כדי להעריך את התועלת של SWE במודלים מכרסמים פרה-קליניים של NASH, בעלי חיים הונחו על דיאטה פרו-NASH ועבר אולטרסאונד לא פולשני B-mode ו גל גיסת אלסטוגרפיה הדמיה כדי למדוד את מדד hepatorenal (HR) וגמישות הכבד, מדידת התקדמות של הצטברות שומן בכבד נוקשות רקמות, בהתאמה, בנקודות זמן מרובות במהלך מחקר NAFLD נתון NAFLD / NASH.
מדד משאבי האנוש ומספרי הגמישות הושוו לסמנים היסתולוגיים של סטאטוזיס ופיברוזיס. התוצאות הראו מתאם חזק בין מדד משאבי אנוש לבין אחוז כתמי O אדום שמן (ORO), כמו גם בין גמישות לבין פיקרו-סיריוס אדום (PSR) כתמים של כבדים. המתאם החזק בין שיטות ex vivo קלאסיות ותוצאות הדמיה in vivo מספק ראיות כי אלסטוגרפיה גל גחלי / הדמיה מבוססת אולטרסאונד ניתן להשתמש כדי להעריך פנוטיפ המחלה והתקדמות במודל פרה-אקליני של NAFLD / NASH.
Introduction
מחלת כבד שומני ללא אלכוהול (NAFLD) היא מצב מטבולי המאופיין על ידי הצטברות מופרזת של שומן בכבד והוא הופך במהירות למחלה כבד מובילה ברחבי העולם עם שכיחות גלובלית שדווחה לאחרונה של 25%1. steatohepatitis ללא אלכוהול (NASH) הוא שלב מתקדם יותר של הספקטרום של NAFLD, המאופיין עודף שומן בכבד עם נזק תאי מתקדם, דלקת, פיברוזיס. מחלות אלה הן לעתים קרובות שקטות, מבלי שיבחינו בהן באמצעות בדיקות דם או בדיקות שגרתיות, עד שכבר נגרם נזק ניכר לכבד של המטופל. נכון לעכשיו, תקן הזהב לאבחון NASH בחולים הוא באמצעות בדיקה היסתולוגית של דגימות ביופסיה בכבד שמקורן בחולה. באופן דומה, חוקרים פרה-קליניים שעובדים כדי להבין את הפתוגנזה של NASH / NAFLD, כמו גם את תעשיית פיתוח התרופות להסתמך על ביופסיה טריז vivo של דגימות כבד או המתת חסד סופנית של קבוצות לווין עבור היסטולוגיה למדוד סטאטוזיס, דלקת, פיברוזיס.
לדוגמה, ביופסיה טריז בכבד כבר טכניקה סטנדרטית להערכת steatohepatitis ופיברוזיס בעת שימוש ב GUBRA NASH מודל2. שיטת הביופסיה של טריז הכבד היא פולשנית ומייגעת בבעלי חיים קטנים3. השימוש ביופסיה כבד טריז באמצע מחקר מייצג משתנה ניסיוני נוסף במודל המחלה, אשר לעתים קרובות מגדיל את מספר בעלי החיים הדרושים. עם גורמים אלה בחשבון, טכניקות הדמיה לא פולשניות שניתן להשתמש בהן כדי להעריך באופן אמין סטאטוזיס ופיברוזיס במודלים בעלי חיים NASH / NAFLD בנקודות זמן מוקדמות להוכיח ערך. אלסטוגרפיה גל הגה (SWE) היא שיטה מבוססת אולטרסאונד המשמשת למדידת האלסטיות של רקמות רכות. הטכניקה מודדת את התפשטות גלי הגיהה שנוצרו על ידי פולסים אולטרסאונד על קוליים המכוונים ליעד רקמה, ולאחר מכן מחשבת ערך הנקרא E modulus4. מהירות גל הגיוע היא פרופורציונלית לדרגת נוקשות הרקמות.
איור 1 ואיור 2 מציגים את הגדרת אזור ההדמיה ואת מכשיר ה-SWE. מכשיר SWE הוא יחידה אחת עם גלגלים עם שני מסכים ולוח בקרה המוצג באיור 2A. הצג העליון (איור 2B) פועל כצג המחשב ומציג תמונות וספריות מטופלים. לוח הבקרה(איור 2C)הוא מערך של לחצנים וחוגים השולטים בהיבטים כלליים של לכידת תמונה: הקפאת מסך, שמירת תמונות, מעבר ממצב אחד למשנהו. המסך התחתון(איור 2D)הוא מסך מגע עם פקדים נוספים לשינוי הגדרות ופועל כלוח מקשים כדי להזין נתונים לפי הצורך. המכשיר מצויד בעט אלקטרוני לשימוש על מסך המגע אם תרצה. בדיקות אולטרסאונד לצרף ללוח הקדמי התחתון של המכשיר. עבור B-מצב ו- SWE הדמיה מכרסמים, מתמר סופר ליניארי 6 עד 20 MHz שימש. יכולת זו למדוד נוקשות רקמות באופן לא פולשני הופכת את SWE לכלי בעל ערך לזיהוי ובימוי של פיברוזיס בכבד5 בחולי NASH, מה שמפחית את הצורך בשיטות פולשניות יותר. SWE, למעשה, שימש למדידת פיברוזיס בכבד בחולים והיא שיטה שאושרה על ידי ה-FDA כדי ציון פיברוזיס במרפאה6. שימוש ב- SWE כדי לעקוב אחר התקדמות NASH במודלים של בעלי חיים של המחלה יספק כלי תרגום לפיתוח טיפולים ובמקביל לשפר את רווחת בעלי החיים באמצעות הפחתת מספרי נושא בעלי חיים ועידון של נהלי in vivo כדי למזער כאב ומצוקה.
דימות SWE בחולים אנושיים משתמש מתמראולטרסאונדבתדר נמוך 4 , אשר אינו אידיאלי עבור בעלי חיים קטנים. ראוי לציין, טכניקות SWE בתדר גבוה שימשו כדי להעריך את היעילות של עיכוב קרבוקסילאז אצטיל-CoA על פתוגנזה של NASH במודל חולדה7, ואת התועלת של טכניקה זו תוארה מודלים חולדת פחמן טטרכלוריד של פיברוזיס הכבד עם תוצאות מוצלחות בהשוואה לשיטות ניקוד היסטולוגי METAVIR המסורתי8. עם זאת, הספרות הקיימת חסרה טכניקה מפורטת ומידע מתודולוגיה על היישום של הדמיית SWE במודלים פרה-אקליניים של NASH. כפי שתואר לעיל, סטאטוזיס הכבד הוא אחד המאפיינים העיקריים של מצב NAFLD / NASH והוא שלב חשוב שבו התערבות יכולה להיחשב. לכן, הערכת הצטברות שומן בכבד באמצעות שיטת הדמיה חשובה כמו הערכת פיברוזיס בכבד במודלים פרה-אקליניים של NASH / NAFLD.
טכניקת אולטרסאונד המכונה מדד משאבי אנוש, יחס של בהירות הרקמה של הכבד לעומת זה של קליפת הכליה, שימש כסמן פונדקאי של סטאטוזיס במרפאה9,10. גישה זו, עם זאת, לא נעשה שימוש נרחב במודלים פרה-אקליניים בעלי חיים של NAFLD / NASH. מאמר זה מתאר שיטה של מדידת גמישות, כמו גם את מדד משאבי אנוש כסמן פונדקאי של פיברוזיס הכבד וסטיאטוזיס, בהתאמה, במודל חולדה דיאטה לקויה כולין, עתיר שומן (CDAHFD) של NAFLD / NASH. מודל זה מעורר סטאטוזיס מהיר, דלקת בכבד, פיברוזיס, אשר ניתן למדידה בתוך 6 שבועות בעכברים11. תוספת של כולסטרול (1%) לתזונה זו הוכח לקדם פירגנזה בחולדות12, מה שהופך מודל זה מועמד מתאים למחקרי אימות מעורבים הדמיית גל גזלה. בסך הכל, טכנולוגיית הדמיה זו יכולה להיות מיושמת גם על מגוון רחב של מודלים / דיאטות NASH שבו סטאטוזיס ו / או פיברוזיס הוא נקודת קצה של עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה מבוססת אולטראסאונד, כולל SWE, יכול להיות כלי לא יסולא בפז להערכה אורכית של סטאטוזיס הכבד ונוקשות במודלים פרה-קליניים של NAFLD / NASH. מאמר זה מתאר מתודולוגיות מפורטות על איך לרכוש באיכות גבוהה B-מצב, כמו גם תמונות SWE של כבדים למדידה של מדד משאבי אנוש וגמישות באמצעות מודל עכברושים הנגרמת על יד…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לצוות התפעול של פייזר לרפואה השוואתית על עבודתם הקשה בטיפול והבטחת בריאותם של בעלי החיים המחקריים, כמו גם סיוע בחלק מהטכניקות. כמו כן, תודה לדניאל קראוול, גארי סייטיס וג’ניפר אשלי אולסון על עזרתם בעיבוד רקמות עבור ניתוחים היסתולוגיים. בנוסף, המחברים רוצים להודות לחוליטה רמירז על סקירה ומתן משוב בעל ערך במהלך הכנת כתב יד זה.
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
Referências
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1 (2018).
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
