NAFLD/NASHラットモデルにおける超音波および剪断波エラストグラフィーイメージングの応用
Summary
このプロトコルは、非アルコール性脂肪性肝疾患のげっ歯類モデルにおける肝臓組織の変化を非侵襲的に観察し、定量化するための強化された超音波技術の使用を記述する。
Abstract
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、肝脂肪蓄積(脂肪化)および線維症につながる炎症を特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)のスペクトル内の状態である。ヒトNASH/NAFLDを密接に再現する前臨床モデルは、医薬品開発に不可欠です。肝臓生検は現在、クリニックでNAFLD/ NASHの進行と診断を測定するためのゴールドスタンダードですが、前臨床空間では、研究中の複数のタイムポイントでの肝臓サンプル全体の収集または肝臓の生検のいずれかが、疾患段階を評価するために組織学的分析に必要です。
肝臓生検の中期研究は侵襲的で労働集約的な手順であり、肝臓サンプルを収集して疾患レベルを評価すると、研究に必要な研究動物の数が増加します。したがって、これらの前臨床モデルでNASH/NAFLDを検出するための信頼性の高い、翻訳可能な非侵襲的なイメージングバイオマーカーが必要です。非侵襲的超音波ベースのB-モード画像および剪断波エラストグラフィー(SWE)は、肝線維症と同様に、ステアトーシスを測定するために使用することができる。NASHの前臨床げっ歯類モデルにおけるSWEの有用性を評価するために、動物はプロNASHダイエットに置かれ、非侵襲的な超音波Bモードおよび剪断波エラストグラフィーイメージングを受け、肝腎(HR)指数および肝臓弾力性を測定し、それぞれ肝臓脂肪蓄積と組織剛性の両方の進行を測定した。
HR指数と弾性数を、スティーアトーシスおよび線維症の組織学的マーカーと比較した。結果は、HR指数とオイルレッドO(ORO)染色の割合、ならびに弾力性とピクロシリウスレッド(PSR)肝臓の染色との間に強い相関関係を示した。古典的な ex vivo 法とin vivo イメージング結果との間の強い相関関係は、NAFLD/NASHの前臨床モデルにおける疾患表現型および進行を評価するために剪断波エラストグラフィー/超音波ベースのイメージングが使用できることを示す証拠を提供する。
Introduction
非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、肝臓における脂肪の過剰な蓄積を特徴とする代謝状態であり、最近報告された世界的な有病率25%1で急速に世界的な肝臓の病気になりつつある。非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は、進行性の細胞損傷、炎症、および線維症を有する過剰な肝臓脂肪を特徴とするNAFLDのスペクトルのより進行した段階である。これらの病気は、患者の肝臓にかなりの損傷が発生するまで、血液検査や定期検査によって検出されない沈黙であることが多い。現在、患者のNASHを診断するためのゴールドスタンダードは、患者由来の肝臓生検サンプルの組織学的検査を通じて行われています。同様に、NASH/NAFLDの病因を理解するために働く前臨床研究者は、肝臓サンプルの生体内バイオプーゼまたは組織学のための衛星コホートの末期安楽死に基づいて、ステアトーシス、炎症、線維症を測定します。
例えば、肝臓ウェッジ生検は、GUBRA NASHモデル2を用いた間に脂肪性肝炎および線維症を評価するための標準的な技術であった。肝臓ウェッジ生検法は、小動物3において侵襲的かつ骨の折れる。研究の途中でくさび肝生検を使用すると、疾患モデルに追加された実験変数が表され、必要な動物の数が増えることが多い。これらの要因を念頭に置いて、早期の時点でNASH / NAFLD動物モデルにおけるスティートーシスおよび線維症を確実に評価するために使用できる非侵襲的なイメージング技術は価値があることを証明する。剪断波エラストグラフィー(SWE)は、軟組織の弾性を測定するために使用される超音波ベースの方法です。この技術は、組織ターゲットに向けられた超音速超音波パルスによって作成されたせん断波の伝播を測定し、次にE率4と呼ばれる値を計算する。せん断波の速度は、組織の剛性の程度に比例します。
図1 と 図2 は、イメージング領域の設定とSWE計測器を示しています。SWEインストゥルメントは、2つの画面と 図2Aに示すコントロールパネルを備えた単一の車輪付きユニットです。上部モニター (図 2B)は、コンピュータモニタとして機能し、画像と患者ディレクトリを表示します。コントロールパネル(図2C)は、画面の凍結、画像の保存、モード間の変更など、画像キャプチャの一般的な側面を制御するボタンとダイヤルの配列です。下の画面(図2D)は、設定を変更するための追加のコントロールを備えたタッチスクリーンであり、必要に応じてデータを入力するためのキーボードとして機能します。楽器は、必要に応じてタッチスクリーン上で使用するスタイラスが装備されています。超音波プローブは、デバイスの下部フロントパネルに取り付けます。げっ歯類におけるBモードおよびSWEイメージングでは、超線形6〜20MHzトランスデューサが使用された。非侵襲的に組織の剛性を測定するこの能力は、SWEをNASH患者における肝線維症5 の同定およびステージングのための貴重なツールとなり、より侵襲的な方法の必要性を減少させる。SWEは、実際には、患者における肝線維症を測定するために使用されており、診療所6で線維症をスコアするFDA承認の方法である。SWEを使用して病気の動物モデルにおけるNASHの進行を監視することは、治療の開発のための翻訳ツールを提供し、同時に痛みや苦痛を最小限に抑えるための動物被験者数の減少と in vivo 手順の洗練を通じて動物の福祉を改善するであろう。
ヒト患者におけるSWEイメージングは、小動物には理想的ではない低周波超音波トランスデューサ4を使用する。特に、高周波SWE技術は、ラットモデル7におけるNASHの病因に対するアセチルCoAカルボキシラーゼ阻害の有効性を評価するために使用されており、この技術の有用性は、従来のMETAVIR組織学的採点方法8と比較した場合に肝線維化の四塩化炭素ラットモデルに記載されている。しかし、既存の文献には、NASHの前臨床モデルにおけるSWEイメージングの応用に関する詳細な技術と方法論情報が欠けている。前述のように、肝ステアトーシスはNAFLD/NASH状態の重要な特徴の1つであり、介入を考慮することができる重要な段階である。したがって、画像化モダリティを用いた肝脂肪蓄積の評価は、NASH/NAFLDの前臨床モデルにおける肝線維症の評価と同様に重要である。
HR指数として知られている超音波技術は、腎皮質のそれと比較して肝臓の組織の明るさの比率、クリニック9、10におけるステアトーシスの代理マーカーとして使用されている。しかし、このアプローチは、NAFLD/NASHの前臨床動物モデルにおいて広く使用されていない。この記事では、NAFLD/NASHのコリン欠乏、高脂肪食(CDAHFD)ラットモデルで、肝線維症と脂肪症の代理マーカーとしてのHR指数と同様に弾力性を測定する方法について説明します。このモデルは、マウス11において6週間以内に測定可能な迅速なスティートーシス、肝臓炎症、および線維症を誘発する。この食事療法へのコレステロール(1%)の添加は、ラット12における線維形成を促進することが示されており、このモデルはせん断波イメージングを含む検証研究に適した候補となる。全体的に、この画像化技術はまた、ステアトーシスおよび/または線維症が関心のエンドポイントであるNASHモデル/ダイエットの広い範囲に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
SWEを含む超音波ベースのイメージングは、NAFLD/NASHの前臨床モデルにおける肝ステアトーシスおよび剛性の縦断評価のための非常に貴重なツールとなり得る。本論文では、NASHのCDAHFDダイエット誘導ラットモデルを用いて、HR指数と弾力性の測定のための肝臓のSWE画像と同様に、高品質のBモードを取得する方法についての詳細な方法論を説明する。また、この結果は、HR指数と弾性と肝臓組織の…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ファイザー比較医学オペレーションチームが研究動物の世話をし、健康を確保し、いくつかの技術を支援してくれたことに感謝したいと考えています。また、ダニエル・クロウエル、ゲイリー・コンピュータス、ジェニファー・アシュリー・オルソンが組織学的分析のための組織処理を手伝ってくれてありがとう。さらに、著者は、この原稿の準備中に貴重なフィードバックを見直し、提供してくれたジュリタ・ラミレスに感謝したいと思います。
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
Referências
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