Aplicação de Ultrassom e Elastografia de Ondas de Cisalhamento em um modelo de rato de NAFLD/NASH

Summary

Este protocolo descreve o uso de uma técnica de ultrassom aprimorada para observar e quantificar invasivamente as alterações nos tecidos hepáticos em modelos de roedores de doença hepática gordurosa não alcoólica.

Abstract

Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é uma condição dentro do espectro da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (NAFLD), que é caracterizada pelo acúmulo de gordura hepática (esteatose) e inflamação que leva à fibrose. Modelos pré-clínicos que recapitulam de perto nash/NAFLD humano são essenciais no desenvolvimento de medicamentos. Embora a biópsia hepática seja atualmente o padrão-ouro para medir a progressão e o diagnóstico de NAFLD/NASH na clínica, no espaço pré-clínico, seja a coleta de amostras de fígado inteiros em vários momentos durante um estudo ou biópsia do fígado é necessária para análise histológica para avaliar o estágio da doença.

A realização de uma biópsia hepática no meio do estudo é um procedimento invasivo e intensivo em mão-de-obra, e coletar amostras hepáticas para avaliar o nível da doença aumenta o número de animais de pesquisa necessários para um estudo. Assim, há a necessidade de um biomarcador de imagem confiável, traduzível e não invasivo para detectar NASH/NAFLD nesses modelos pré-clínicos. Imagens não invasivas do modo B baseadas em ultrassom e shear wave elastography (SWE) podem ser usadas para medir esteatose, bem como fibrose hepática. Para avaliar a utilidade da SWE em modelos de roedores pré-clínicos de NASH, os animais foram colocados em uma dieta pró-NASH e foram submetidos ao modo B de ultrassom não invasivo e à imagem de elastografia de ondas de cisalhamento para medir o índice hepato-feminino (HR) e a elasticidade hepática, medindo a progressão tanto do acúmulo de gordura hepática quanto da rigidez tecidual, respectivamente, em vários pontos de tempo ao longo de um determinado estudo NAFLD/NASH.

O índice de RH e os números de elasticidade foram comparados aos marcadores histológicos de esteatose e fibrose. Os resultados mostraram forte correlação entre o índice de RH e o percentual de manchas de O Vermelho Óleo (ORO), bem como entre a elasticidade e a coloração picro-sirius vermelha (RSE) dos fígados. A forte correlação entre métodos clássicos ex vivo e resultados de imagem in vivo fornece evidências de que a elastografia de ondas de cisalhamento/imagem baseada em ultrassom pode ser usada para avaliar o fenótipo da doença e a progressão em um modelo pré-clínico de NAFLD/NASH.

Introduction

A doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) é uma condição metabólica caracterizada por um acúmulo excessivo de gordura no fígado e está rapidamente se tornando uma doença hepática líder em todo o mundo com uma prevalência global recentemente relatada de 25%¹. Esteatohepatite não alcoólica (NASH) é um estágio mais progressivo do espectro de NAFLD, caracterizado pelo excesso de gordura hepática com dano celular progressivo, inflamação e fibrose. Essas doenças são muitas vezes silenciosas, não detectadas através de exames de sangue ou exames de rotina, até que danos consideráveis já tenham ocorrido ao fígado de um paciente. Atualmente, o padrão-ouro para diagnosticar NASH em pacientes é através de exame histológico de amostras de biópsia hepática derivadas do paciente. Da mesma forma, pesquisadores pré-clínicos que trabalham para entender a patogênese de NASH/NAFLD, bem como a indústria de desenvolvimento de medicamentos, dependem da biópsia in vivo de amostras de fígado ou eutanásia terminal de coortes de satélite para histologia para medir esteatose, inflamação e fibrose.

Por exemplo, a biópsia da cunha hepática tem sido uma técnica padrão para avaliar esteatohepatite e fibrose durante o uso do modelo GUBRA NASH². O método de biópsia da cunha hepática é invasivo e trabalhoso em animais pequenos³. O uso de biópsia hepática cunhada no meio de um estudo representa uma variável experimental adicionada em um modelo de doença, o que muitas vezes aumenta o número de animais que são necessários. Com esses fatores em mente, técnicas de imagem não invasivas que podem ser usadas para avaliar de forma confiável a esteatose e a fibrose em modelos animais NASH/NAFLD em pontos de tempo inicial se mostram valiosas. Shear wave elastography (SWE) é um método baseado em ultrassom usado para medir a elasticidade dos tecidos moles. A técnica mede a propagação de ondas de cisalhamento criadas por pulsos de ultrassom supersônicos direcionados a um alvo tecidual e, em seguida, calcula um valor chamado E modulus⁴. A velocidade da onda de tesoura é proporcional ao grau de rigidez tecidual.

As figuras 1 e figura 2 mostram a configuração da área de imagem e o instrumento SWE. O instrumento SWE é uma unidade única com duas telas e um painel de controle mostrado na Figura 2A. O monitor superior (Figura 2B) atua como monitor de computador e exibe imagens e diretórios do paciente. O painel de controle (Figura 2C) é uma matriz de botões e mostradores que controlam aspectos gerais da captura de imagem: congelar tela, salvar imagens, mudar de um modo para outro. A tela inferior(Figura 2D) é uma tela sensível ao toque com controles adicionais para alterar configurações e age como um teclado para inserir dados conforme necessário. O instrumento é equipado com uma caneta para usar na tela de toque, se desejar. As sondas de ultrassom se prendem ao painel frontal inferior do dispositivo. Para o modo B e a imagem SWE em roedores, foi utilizado o transdutor super-linear de 6 a 20 MHz. Essa capacidade de medir não invasivamente a rigidez tecidual faz da SWE uma ferramenta valiosa para a identificação e estadiamento da fibrose hepática⁵ em pacientes nash, diminuindo a necessidade de métodos mais invasivos. A SWE tem sido, de fato, usada para medir a fibrose hepática em pacientes e é um método aprovado pela FDA para escorar fibrose na clínica⁶. O uso da SWE para monitorar a progressão do NASH em modelos animais da doença forneceria uma ferramenta translacional para o desenvolvimento de tratamentos e, simultaneamente, melhoraria o bem-estar animal através da redução do número de indivíduos animais e do refinamento de procedimentos in vivo para minimizar a dor e a angústia.

A imagem SWE em pacientes humanos usa um transdutor de ultrassom de baixa frequência⁴, o que não é ideal para animais de pequeno porte. Notavelmente, técnicas de SWE de alta frequência têm sido utilizadas para avaliar a eficácia da inibição de acetil-CoA em patogênese de NASH em um modelo⁷de ratos , e a utilidade desta técnica tem sido descrita em modelos de ratos tetraclorito de carbono de fibrose hepática com resultados bem sucedidos quando comparados aos métodos tradicionais de pontuação histológica METAVIR⁸. No entanto, a literatura existente carece de informações detalhadas sobre a aplicação de imagens SWE em modelos pré-clínicos de NASH. Como descrito acima, a esteatose hepática é uma das principais características da condição NAFLD/NASH e é um estágio importante onde a intervenção pode ser considerada. Assim, avaliar o acúmulo de gordura hepática utilizando uma modalidade de imagem é tão importante quanto avaliar a fibrose hepática em modelos pré-clínicos de NASH/NAFLD.

Uma técnica de ultrassom conhecida como índice de RH, uma razão de brilho tecidual do fígado em comparação com a do córtex renal, tem sido usada como marcador substituto de esteatose na clínica^9,10. Esta abordagem, no entanto, não tem sido amplamente utilizada em modelos animais pré-clínicos de NAFLD/NASH. Este artigo descreve um método de medição da elasticidade, bem como o índice de RH como um marcador substituto de fibrose hepática e esteatose, respectivamente, em um modelo de rato deficiente em colina e alta gordura (CDAHFD) do NAFLD/NASH. Este modelo induz esteatose rápida, inflamação hepática e fibrose, que é mensurável dentro de 6 semanas em camundongos¹¹. A adição de colesterol (1%) a esta dieta tem sido demonstrada para promover a fibrogênese em ratos¹², tornando este modelo um candidato adequado para estudos de validação envolvendo imagens de ondas de tesoura. No geral, essa tecnologia de imagem também pode ser aplicada a uma ampla gama de modelos/dietas NASH onde a esteatose e/ou fibrose é um ponto final de interesse.

Protocol

Todos os procedimentos envolventes aos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Pfizer e realizados em uma unidade credenciada internacional da AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care). 1. Indução de doenças Use ratos Wister Han machos (150-175 g; ~ 6-7 semanas de idade; total de 40 ratos) que estão livres de patógenos avencionários de ratos conhecidos. Abriga os ratos em pares em caging indivi…

Representative Results

Uma marca registrada dos animais alimentados com CDAHFD é a esteatose. O acúmulo de gordura no fígado altera as propriedades ecogênicas do tecido, que podem ser quantificadas medindo o brilho do fígado e normalizando-o ao brilho do córtex renal a partir de uma imagem do modo B tirada no mesmo plano. O valor quantificado é expresso como um índice de RH, que é uma medida indireta de esteatose. Na Figura 4A,uma imagem hepática representativa de um animal de controle mostra aproximadam…

Discussion

Imagens baseadas em ultrassom, incluindo SWE, podem ser uma ferramenta inestimável para a avaliação longitudinal da esteatose hepática e rigidez em modelos pré-clínicos de NAFLD/NASH. Este artigo descreve metodologias detalhadas sobre como adquirir o modo B de alta qualidade, bem como imagens de SWE de fígados para a medição do índice de RH e elasticidade usando um modelo de rato induzido pela dieta CDAHFD de NASH. Além disso, os resultados mostram excelente correlação do índice de RH e elasticidade com o p…

Materials

Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubricatn to prevent eye dryness  during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Wistar Han rats	Charles River Laboratories