Применение ультразвуковой и сдвиговой эластографии в крысиной модели НАЖБ НАЖБ/НАСГ

Summary

Этот протокол описывает использование расширенной ультразвуковой техники для неинвазивного наблюдения и количественной оценки изменений ткани печени в моделях грызунов с неалкогольной жировой болезнью печени.

Abstract

Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является состоянием в спектре неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая характеризуется накоплением жира в печени (стеатоз) и воспалением, приводящим к фиброзу. Доклинические модели, близко переименовывающие НАСГ/НАЖБП человека, имеют важное значение для разработки лекарств. В то время как биопсия печени в настоящее время является золотым стандартом для измерения прогрессирования и диагностики НАЖБП / НАСГ в клинике, в доклиническом пространстве для гистологического анализа для оценки стадии заболевания необходим либо сбор целых образцов печени в нескольких временных точках во время исследования, либо биопсия печени.

Проведение биопсии печени в середине исследования является инвазивной и трудоемкой процедурой, а сбор образцов печени для оценки уровня заболевания увеличивает количество исследовательских животных, необходимых для исследования. Таким образом, существует потребность в надежном, переводимом, неинвазивном биомаркере визуализации для обнаружения НАСГ/НАЖБД в этих доклинических моделях. Неинвазивные ультразвуковые изображения B-режима и эластография сдвиговых волн (SWE) могут использоваться для измерения стеатоза, а также фиброза печени. Чтобы оценить полезность SWE в доклинических моделях НАСГ для грызунов, животных поместили на диету с про-НАСГ и подвергли неинвазивной ультразвуковой визуализации B-мод и эластографии сдвиговых волн для измерения гепаторенального (ЧСС) индекса и эластичности печени, измеряя прогрессирование как накопления жира в печени, так и жесткости тканей, соответственно, в нескольких временных точках в течение данного исследования НАЖБП / НАСГ.

Индекс ЧС и показатели эластичности сравнивали с гистологическими маркерами стеатоза и фиброза. Результаты показали сильную корреляцию между индексом HR и процентом окрашивания Oil Red O (ORO), а также между эластичностью и окрашиванием печени Picro-Sirius Red (PSR). Сильная корреляция между классическими методами ex vivo и результатами визуализации in vivo свидетельствует о том, что эластография сдвиговых волн / ультразвуковая визуализация могут быть использованы для оценки фенотипа и прогрессирования заболевания в доклинической модели НАЖБП/НАСГ.

Introduction

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является метаболическим состоянием, характеризующимся чрезмерным накоплением жира в печени, и быстро становится ведущим заболеванием печени во всем мире с недавно зарегистрированной глобальной распространенностью 25%^1. Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является более прогрессирующей стадией спектра НАЖБП, характеризующейся избытком жира печени с прогрессирующим повреждением клеток, воспалением и фиброзом. Эти недуги часто молчат, не обнаруживаются с помощью анализов крови или обычных осмотров, пока не произошло значительное повреждение печени пациента. В настоящее время золотым стандартом для диагностики НАСГ у пациентов является гистологическое исследование образцов биопсии печени, полученных пациентом. Аналогичным образом, доклинические исследователи, которые работают над пониманием патогенеза НАСГ / НАЖБП, а также индустрии разработки лекарств, полагаются на биопсию клина in vivo образцов печени или терминальную эвтаназию спутниковых когорт для гистологии для измерения стеатоза, воспаления и фиброза.

Например, клиновидная биопсия печени была стандартным методом оценки стеатогепатита и фиброза при использовании модели GUBRA NASH^2. Метод клиновидной биопсии печени является инвазивным и трудоемким у мелких животных^3. Использование клиновидной биопсии печени в середине исследования представляет собой дополнительную экспериментальную переменную в модели заболевания, которая часто увеличивает количество необходимых животных. Учитывая эти факторы, неинвазивные методы визуализации, которые могут быть использованы для надежной оценки стеатоза и фиброза в животных моделях НАСГ / НАЖБВ в ранние моменты времени, оказываются ценными. Эластография сдвиговых волн (SWE) – это ультразвуковой метод, используемый для измерения эластичности мягких тканей. Метод измеряет распространение волн сдвига, создаваемых сверхзвуковыми ультразвуковыми импульсами, направленными на тканевую мишень, а затем вычисляет значение, называемое модулем E^4. Скорость волны сдвига пропорциональна степени жесткости тканей.

На рисунках 1 и 2 показана настройка области визуализации и прибор SWE. Прибор SWE представляет собой один колесный блок с двумя экранами и панелью управления, показанный на рисунке 2A. Верхний монитор(рисунок 2B)действует как монитор компьютера и отображает изображения и каталоги пациентов. Панель управления(рисунок 2C)представляет собой массив кнопок и циферблатов, которые управляют общими аспектами захвата изображения: замораживание экрана, сохранение изображений, переход из одного режима в другой. Нижний экран(рисунок 2D)представляет собой сенсорный экран с дополнительными элементами управления для изменения настроек и действует как клавиатура для ввода данных по мере необходимости. Прибор оснащен стилусом для использования на сенсорном экране при желании. Ультразвуковые зонды крепятся к нижней передней панели прибора. Для визуализации B-режима и SWE у грызунов использовался суперлинейный преобразователь от 6 до 20 МГц. Эта способность неинвазивно измерять жесткость тканей делает SWE ценным инструментом для идентификации и постановки фиброза печени⁵ у пациентов с НАСГ, уменьшая потребность в более инвазивных методах. SWE, фактически, использовался для измерения фиброза печени у пациентов и является одобренным FDA методом оценки фиброза в клинике^6. Использование SWE для мониторинга прогрессирования НАСГ на животных моделях заболевания обеспечит трансляционный инструмент для разработки методов лечения и одновременно улучшит благополучие животных за счет сокращения числа животных и совершенствования процедур in vivo для минимизации боли и дистресса.

SWE-визуализация у пациентов с человеческим контролем использует низкочастотный ультразвуковой преобразователь^4,который не идеален для мелких животных. Примечательно, что высокочастотные методы SWE были использованы для оценки эффективности ингибирования ацетил-КоА-карбоксилазы на патогенез НАСГ в модели⁷крыс, и полезность этого метода была описана в тетрахлорметановых крысах, моделях фиброза печени с успешными результатами по сравнению с традиционными методами гистологической оценки METAVIR^8. Однако в существующей литературе отсутствует подробная информация о технике и методологии применения визуализации SWE в доклинических моделях НАСГ. Как описано выше, стеатоз печени является одной из ключевых особенностей состояния НАЖБВ/НАСГ и является важным этапом, на котором может быть рассмотрено вмешательство. Таким образом, оценка накопления жира в печени с использованием метода визуализации так же важна, как и оценка фиброза печени в доклинических моделях НАСГ/НАЖБП.

Ультразвуковой метод, известный как индекс ЧС, соотношение яркости тканей печени по сравнению с почечной корой, был использован в качестве суррогатного маркера стеатоза в клинике^9,10. Этот подход, однако, не был широко использован в доклинических животных моделях НАЖБЛ/НАСГ. В этой статье описывается метод измерения эластичности, а также индекса ЧСС в качестве суррогатного маркера фиброза и стеатоза печеночной области, соответственно, в модели крыс с дефицитом холина и высоким содержанием жиров (CDAHFD) НАЖБП/НАСГ. Эта модель вызывает быстрый стеатоз, воспаление печени и фиброз, который можно измерить в течение 6 недель у мышей^11. Было показано, что добавление холестерина (1%) к этой диете способствует фиброгенезу у крыс^12,что делает эту модель подходящим кандидатом для валидационных исследований, включающих визуализацию сдвиговых волн. В целом, эта технология визуализации также может быть применена к широкому спектру моделей / диет НАСГ, где стеатоз и / или фиброз являются конечной точкой интереса.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом pfizer по уходу за животными и их использованию (IACUC) и проведены в международном аккредитованном учреждении AAALAC (Оценка и аккредитация по уходу за лабораторными животными). 1. Индук…

Representative Results

Одной из отличительных черт животных, которых кормят CDAHFD, является стеатоз. Накопление жира в печени изменяет эхогенные свойства ткани, которые можно количественно оценить, измерив яркость печени и нормализовав ее до яркости коры почек по изображению В-мода, сделанному в той же плоскос…

Discussion

Ультразвуковая визуализация, включая SWE, может быть бесценным инструментом для продольной оценки стеатоза печени и жесткости в доклинических моделях НАЖБВ/НАСГ. В этой статье описываются подробные методологии получения высококачественного B-режима, а также SWE-изображений печени для и?…

Materials

Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubricatn to prevent eye dryness  during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Wistar Han rats	Charles River Laboratories