Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH

Summary

Este protocolo describe el uso de una técnica de ultrasonido mejorada para observar y cuantificar de manera no invasiva los cambios en el tejido hepático en modelos de roedores de enfermedad del hígado graso no alcohólico.

Abstract

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una afección dentro del espectro de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), que se caracteriza por la acumulación de grasa hepática (esteatosis) y la inflamación que conduce a la fibrosis. Los modelos preclínicos que recapitulan de cerca la EHNA/EHGNA humana son esenciales en el desarrollo de fármacos. Si bien la biopsia hepática es actualmente el estándar de oro para medir la progresión y el diagnóstico de NAFLD / NASH en la clínica, en el espacio preclínico, se necesita la recolección de muestras de hígado completo en múltiples puntos de tiempo durante un estudio o la biopsia de hígado para el análisis histológico para evaluar la etapa de la enfermedad.

La realización de una biopsia hepática a mitad del estudio es un procedimiento invasivo y laborioso, y la recolección de muestras de hígado para evaluar el nivel de enfermedad aumenta el número de animales de investigación necesarios para un estudio. Por lo tanto, existe la necesidad de un biomarcador de imágenes confiable, traducible y no invasivo para detectar NASH / NAFLD en estos modelos preclínicos. Las imágenes no invasivas en modo B basadas en ultrasonido y la elastografía de onda de cizallamiento (SWE) se pueden usar para medir la esteatosis y la fibrosis hepática. Para evaluar la utilidad de SWE en modelos preclínicos de roedores de NASH, los animales se colocaron en una dieta pro-NASH y se sometieron a imágenes de ultrasonido no invasivas en modo B y elastografía de onda de corte para medir el índice hepatorrenal (HR) y la elasticidad hepática, midiendo la progresión de la acumulación de grasa hepática y la rigidez del tejido, respectivamente, en múltiples puntos de tiempo en el transcurso de un estudio NAFLD / NASH dado.

El índice de HR y los números de elasticidad se compararon con los marcadores histológicos de esteatosis y fibrosis. Los resultados mostraron una fuerte correlación entre el índice HR y el porcentaje de tinción oil red O (ORO), así como entre la elasticidad y la tinción Picro-Sirius Red (PSR) de los hígados. La fuerte correlación entre los métodos ex vivo clásicos y los resultados de las imágenes in vivo proporciona evidencia de que la elastografía de onda de corte / imágenes basadas en ultrasonido se pueden usar para evaluar el fenotipo y la progresión de la enfermedad en un modelo preclínico de NAFLD / NASH.

Introduction

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) es una condición metabólica caracterizada por una acumulación excesiva de grasa en el hígado y se está convirtiendo rápidamente en una dolencia hepática líder en todo el mundo con una prevalencia global recientemente reportada del 25%¹. La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una etapa más progresiva del espectro de la EHGNA, caracterizada por un exceso de grasa hepática con daño celular progresivo, inflamación y fibrosis. Estas dolencias a menudo son silenciosas, no se detectan a través de análisis de sangre o exámenes de rutina, hasta que ya se ha producido un daño considerable en el hígado de un paciente. Actualmente, el estándar de oro para diagnosticar la EHNA en pacientes es a través del examen histológico de muestras de biopsia hepática derivadas del paciente. Del mismo modo, los investigadores preclínicos que trabajan para comprender la patogénesis de NASH / NAFLD, así como la industria del desarrollo de medicamentos, se basan en la biopsia en cuña in vivo de muestras de hígado o la eutanasia terminal de cohortes satélites para la histología para medir la esteatosis, la inflamación y la fibrosis.

Por ejemplo, la biopsia en cuña hepática ha sido una técnica estándar para evaluar la esteatohepatitis y la fibrosis utilizando el modelo GUBRA NASH^2. El método de biopsia en cuña hepática es invasivo y laborioso en animales pequeños³. El uso de la biopsia hepática en cuña en medio de un estudio representa una variable experimental adicional en un modelo de enfermedad, que a menudo aumenta el número de animales que se necesitan. Con estos factores en mente, las técnicas de imagen no invasivas que se pueden utilizar para evaluar de manera confiable la esteatosis y la fibrosis en modelos animales NASH / NAFLD en puntos de tiempo tempranos resultan valiosas. La elastografía de onda de cizalla (SWE) es un método basado en ultrasonido utilizado para medir la elasticidad de los tejidos blandos. La técnica mide la propagación de las ondas de cizallamiento creadas por pulsos de ultrasonido supersónico dirigidos a un objetivo tisular, y luego calcula un valor llamado módulo E^4. La velocidad de la onda de cizallamiento es proporcional al grado de rigidez del tejido.

La Figura 1 y la Figura 2 muestran la configuración del área de imágenes y el instrumento SWE. El instrumento SWE es una unidad única con ruedas con dos pantallas y un panel de control que se muestra en la Figura 2A. El monitor superior(Figura 2B)actúa como monitor de ordenador y muestra imágenes y directorios de pacientes. El panel de control(Figura 2C)es una serie de botones y diales que controlan aspectos generales de la captura de imágenes: congelar la pantalla, guardar imágenes, cambiar de un modo a otro. La pantalla inferior(Figura 2D)es una pantalla táctil con controles adicionales para cambiar la configuración y actúa como un teclado para ingresar datos según sea necesario. El instrumento está equipado con un lápiz óptico para usar en la pantalla táctil si lo desea. Las sondas de ultrasonido se conectan al panel frontal inferior del dispositivo. Para las imágenes en modo B y SWE en roedores, se utilizó el transductor superlineal de 6 a 20 MHz. Esta capacidad de medir de forma no invasiva la rigidez tisular hace de SWE una herramienta valiosa para la identificación y estadificación de la fibrosis hepática⁵ en pacientes con EHNA, disminuyendo la necesidad de métodos más invasivos. SWE, de hecho, se ha utilizado para medir la fibrosis hepática en pacientes y es un método aprobado por la FDA para puntuar la fibrosis en la clínica⁶. El uso de SWE para monitorear la progresión de la EHNA en modelos animales de la enfermedad proporcionaría una herramienta de traducción para el desarrollo de tratamientos y, al mismo tiempo, mejoraría el bienestar animal a través de la reducción del número de sujetos animales y el refinamiento de los procedimientos in vivo para minimizar el dolor y la angustia.

Las imágenes SWE en pacientes humanos utilizan un transductor de ultrasonido de baja frecuencia^4,que no es ideal para animales pequeños. En particular, se han utilizado técnicas de SWE de alta frecuencia para evaluar la eficacia de la inhibición de la acetil-CoA carboxilasa en la patogénesis de NASH en un modelo^{de rata 7,}y la utilidad de esta técnica se ha descrito en modelos de ratas con tetracloruro de carbono de fibrosis hepática con resultados exitosos en comparación con los métodos tradicionales de puntuación histológica METAVIR⁸. Sin embargo, la literatura existente carece de información detallada sobre la técnica y la metodología sobre la aplicación de imágenes deWE en modelos preclínicos de NASH. Como se describió anteriormente, la esteatosis hepática es una de las características clave de la afección NAFLD / NASH y es una etapa importante en la que se puede considerar la intervención. Por lo tanto, evaluar la acumulación de grasa hepática utilizando una modalidad de imagen es tan importante como evaluar la fibrosis hepática en modelos preclínicos de NASH / NAFLD.

Una técnica ecográfico conocida como índice HR, una relación del brillo tisular del hígado en comparación con la de la corteza renal, se ha utilizado como marcador sustituto de esteatosis en la clínica^9,10. Este enfoque, sin embargo, no se ha utilizado ampliamente en modelos animales preclínicos de NAFLD/NASH. Este artículo describe un método para medir la elasticidad, así como el índice hr como un marcador sustituto de fibrosis hepática y esteatosis, respectivamente, en un modelo de rata de dieta alta en grasas y deficiente en colina (CDAHFD) de NAFLD / NASH. Este modelo induce esteatosis rápida, inflamación hepática y fibrosis, que es medible dentro de las 6 semanas en ratones¹¹. Se ha demostrado que la adición de colesterol (1%) a esta dieta promueve la fibrogénesis en^{ratas 12,}lo que convierte a este modelo en un candidato adecuado para estudios de validación que involucran imágenes de ondas de cizalla. En general, esta tecnología de imágenes también se puede aplicar a una amplia gama de modelos / dietas NASH donde la esteatosis y / o fibrosis es un punto final de interés.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Pfizer y se llevaron a cabo en una instalación acreditada internacionalmente por AAALAC (Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio). 1. Inducción de la enfermedad Use ratas Wister Han macho (150-175 g; ~ 6-7 semanas de edad; total de 40 ratas) que estén libres de patógenos adventiciales de ratas conocidos. Al…

Representative Results

Un sello distintivo de los animales alimentados con CDAHFD es la esteatosis. La acumulación de grasa en el hígado cambia las propiedades ecogénicas del tejido, que se pueden cuantificar midiendo el brillo del hígado y normalizándolo al brillo de la corteza renal a partir de una imagen en modo B tomada en el mismo plano. El valor cuantificado se expresa como un índice de HR, que es una medida indirecta de la esteatosis. En la Figura 4A,una imagen hepática representativa de un animal de…

Discussion

Las imágenes basadas en ultrasonido, incluido SWE, pueden ser una herramienta invaluable para la evaluación longitudinal de la esteatosis hepática y la rigidez en modelos preclínicos de NAFLD / NASH. Este artículo describe metodologías detalladas sobre cómo adquirir el modo B de alta calidad, así como imágenes SWE de hígados para la medición del índice de FC y la elasticidad utilizando un modelo de rata de NASH inducido por la dieta CDAHFD. Además, los resultados muestran una excelente correlación del índi…

Materials

Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubricatn to prevent eye dryness  during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Wistar Han rats	Charles River Laboratories