Tillämpning av ultraljud och skjuvvåg elastografi imaging i en råtta modell av NAFLD/NASH
Summary
Detta protokoll beskriver användningen av en förbättrad ultraljud teknik att icke-invasivt observera och kvantifiera levervävnad förändringar i gnagare modeller av alkoholfri fettlever sjukdom.
Abstract
Alkoholfri Steatohepatitis (NASH) är ett tillstånd inom spektrumet av alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), som kännetecknas av ackumulering av leverfett (steatos) och inflammation som leder till fibros. Prekliniska modeller som nära rekapitlar mänskliga NASH/NAFLD är viktiga i läkemedelsutveckling. Medan leverbiopsi för närvarande är guldstandarden för att mäta NAFLD/ NASH progression och diagnos i kliniken, i det prekliniska utrymmet, antingen insamling av hela leverprover vid flera tidpunkter under en studie eller biopsi av lever behövs för histologisk analys för att bedöma sjukdomsstadiet.
Att genomföra en leverbiopsi mitt i studien är ett invasivt och arbetsintensivt förfarande, och insamling av leverprover för att bedöma sjukdomsnivå ökar antalet forskningsdjur som behövs för en studie. Således finns det ett behov av en tillförlitlig, översättbar, icke-invasiv bildåtergivning biomarkör för att upptäcka NASH/NAFLD i dessa prekliniska modeller. Icke-invasiva ultraljudsbaserade B-lägesbilder och Shear Wave Elastography (SWE) kan användas för att mäta steatos samt leverfibros. För att bedöma nyttan av SWE i prekliniska gnagaremodeller av NASH placerades djur på en pro-NASH-diet och genomgick icke-invasiv ultraljud B-läge och shear wave elastography imaging för att mäta hepatorenal (HR) index och leverelasticitet, mäta progression av både leverfett ackumulering respektive vävnad styvhet, vid flera tidpunkter under loppet av en given NAFLD /NASH studie.
HR index och elasticitet siffror jämfördes med histologiska markörer av steatosis och fibros. Resultaten visade en stark korrelation mellan HR-indexet och procentandelen oil red o (ORO) färgning, liksom mellan elasticitet och Picro-Sirius Red (PSR) färgning av lever. Den starka korrelationen mellan klassiska ex vivo-metoder och in vivo-bildbehandlingsresultat ger bevis för att shear wave elastography/ultraljud-baserad avbildning kan användas för att bedöma sjukdomen fenotyp och progression i en preklinisk modell av NAFLD/NASH.
Introduction
Alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) är ett metaboliskt tillstånd som kännetecknas av en överdriven uppbyggnad av fett i levern och blir snabbt en ledande leversjukdom över hela världen med en nyligen rapporterad global prevalens på 25%1. Alkoholfri steatohepatit (NASH) är ett mer avancerat stadium av spektrumet av NAFLD, kännetecknas av överskott av leverfett med progressiv cellulär skada, inflammation och fibros. Dessa sjukdomar är ofta tysta, oupptäckta via blodprov eller rutinundersökningar, tills betydande skador redan har uppstått på en patients lever. För närvarande är guldstandarden för att diagnostisera NASH hos patienter genom histologisk undersökning av patientbaserade leverbiopsiprover. På samma sätt förlitar sig prekliniska forskare som arbetar för att förstå patogenesen vid NASH/ NAFLD samt läkemedelsutvecklingsindustrin på in vivo wedge biopsi av leverprover eller terminal dödshjälp av satellitkohorter för histologi för att mäta steatos, inflammation och fibros.
Till exempel har leverkilbiopsi varit en standardteknik för att bedöma steatohepatit och fibros när du använder GUBRA NASH-modellen2. Leverkilens biopsimetod är invasiv och mödosam hos små djur3. Användningen av wedge leverbiopsi i mitten av en studie representerar en extra experimentell variabel i en sjukdomsmodell, vilket ofta ökar antalet djur som behövs. Med dessa faktorer i åtanke visar sig icke-invasiva bildframställningstekniker som kan användas för att tillförlitligt bedöma steatos och fibros i NASH/ NAFLD djurmodeller vid tidiga tidpunkter vara värdefulla. Shear wave elastography (SWE) är en ultraljudsbaserad metod som används för att mäta elasticiteten hos mjuka vävnader. Tekniken mäter förökningen av saxvågor skapade av överljuds ultraljudspulser riktade mot ett vävnadsmål och beräknar sedan ett värde som kallas E modulus4. Snjuvvågens hastighet står i proportion till graden av vävnadsstelhet.
Figur 1 och figur 2 visar bildområdesinställningen och SWE-instrumentet. SWE-instrumentet är en enda hjulenhet med två skärmar och en kontrollpanel som visas i figur 2A. Den övre bildskärmen( figur 2B) fungerar som datorskärm och visar bilder och patientkataloger. Kontrollpanelen (Figur 2C) är en matris med knappar och rattar som styr allmänna aspekter av bildinspelning: frysskärm, spara bilder, ändra från ett läge till ett annat. Den nedre skärmen (Figur 2D) är en pekskärm med ytterligare kontroller för att ändra inställningar och fungerar som ett tangentbord för att mata in data efter behov. Instrumentet är utrustat med en penna att använda på pekskärmen om så önskas. Ultraljudssonder fästs på enhetens nedre frontpanel. För B-läge och SWE-avbildning hos gnagare användes den superlinjesnära 6 till 20 MHz-givaren. Denna förmåga att icke-invasivt mäta vävnadsstelhet gör SWE till ett värdefullt verktyg för identifiering och iscensättning av leverfibros5 hos NASH-patienter, vilket minskar behovet av mer invasiva metoder. SWE har i själva verket använts för att mäta leverfibros hos patienter och är en FDA-godkänd metod för att få fibros på kliniken6. Att använda SWE för att övervaka NASH-utvecklingen i djurmodeller av sjukdomen skulle vara ett översättningsverktyg för utveckling av behandlingar och samtidigt förbättra djurens välbefinnande genom att minska antalet djurförsök och förfining av in vivo-procedurer för att minimera smärta och ångest.
SWE imaging hos mänskliga patienter använder en lågfrekvent ultraljudsgivare4, som inte är idealisk för små djur. Särskilt högfrekventa SWE-tekniker har använts för att utvärdera effekten av acetyl-CoA karboxylashämning på patogenes av NASH i en råttamodell 7, och nyttan av denna teknik har beskrivits i koltetraklorid råtta modeller av leverfibros med framgångsrika resultat jämfört med traditionella METAVIR histologiska poängmetoder8. Den befintliga litteraturen saknar dock detaljerad teknik- och metodinformation om tillämpningen av SWE imaging i prekliniska modeller av NASH. Som beskrivits ovan, lever steatosis är en av de viktigaste funktionerna i NAFLD/NASH villkoret och är ett viktigt steg där ingripande kan övervägas. Således, bedöma lever fett ackumulering med hjälp av en imaging modalitet är lika viktigt som att bedöma lever fibros i prekliniska modeller av NASH/NAFLD.
En ultraljudsteknik som kallas HR-indexet, ett förhållande av leverns vävnadsljushet jämfört med njurbarkens, har använts som surrogatmarkör av steatos ikliniken 9,10. Detta tillvägagångssätt har dock inte använts i någon större utsträckning i prekliniska djurmodeller av NAFLD/NASH. Denna artikel beskriver en metod för att mäta elasticitet samt HR-indexet som en surrogatmarkör av leverfibros respektive steatos, i en kolin-bristfällig, fettrik diet (CDAHFD) råtta modell av NAFLD/NASH. Denna modell inducerar snabb steatos, leverinflammation och fibros, vilket är mätbart inom 6 veckor hos möss11. Tillsats av kolesterol (1%) till denna diet har visat sig främja fibrogenes hos råttor12, vilket gör denna modell till en lämplig kandidat för valideringsstudier som involverar skjuvvågsavbildning. Sammantaget kan denna bildteknik också tillämpas på ett brett spektrum av NASH-modeller/dieter där steatos och/eller fibros är en slutpunkt av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ultraljudsbaserad avbildning, inklusive SWE, kan vara ett ovärderligt verktyg för longitudinell bedömning av leversteatos och styvhet i prekliniska modeller av NAFLD/NASH. Detta dokument beskriver detaljerade metoder för hur man förvärvar högkvalitativa B-läge samt SWE-bilder av lever för mätning av HR-index och elasticitet med hjälp av en CDAHFD diet-inducerad råtta modell av NASH. Vidare visar resultaten utmärkt korrelation mellan HR-indexet och elasticitet med guldstandarden för utvärdering-histologisk …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Pfizer Comparative Medicine Operations Team för deras hårda arbete med att ta hand om och säkerställa studiedjurens hälsa samt hjälpa till med några av teknikerna. Tack också till Danielle Crowell, Gary Seitis och Jennifer Ashley Olson för deras hjälp med vävnadsbehandling för histologiska analyser. Dessutom vill författarna tacka Julita Ramirez för att ha granskat och gett värdefull feedback under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
Referências
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine. 2018 Scientific Program. Journal of Ultrasound in Medicine. 37 (1), 1 (2018).
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
