NAFLD/NASH의 쥐 모형에 초음파 및 전단 파 단층 사진 의 응용
Summary
이 프로토콜은 비침습적으로 비 알코올 성 지방 간 질환의 설치류 모델에서 간 조직 변화를 관찰하고 정량화하기 위해 향상된 초음파 기술의 사용을 설명합니다.
Abstract
무알코올 성 세포 간염 (NASH)은 간 지방 축적 (steatosis) 및 섬유증으로 이어지는 염증을 특징으로하는 비 알코올 성 지방 간 질환 (NAFLD)의 스펙트럼 내에서 상태입니다. 인간 NASH/NAFLD를 밀접하게 재구성하는 전임상 모델은 약물 개발에 필수적입니다. 간 생검은 현재 클리닉에서 NAFLD /NASH 진행 및 진단을 측정하기위한 금 본위제이지만, 전임상 공간에서, 연구 중 여러 시점에서 전체 간 샘플의 수집 또는 간 생검은 질병 단계를 평가하기 위해 조직학적 분석을 위해 필요합니다.
간 생검 중간 연구를 수행하는 것은 침략적이고 노동 집약적인 절차이며, 질병 수준을 평가하기 위해 간 샘플을 수집하면 연구에 필요한 연구 동물의 수가 증가합니다. 따라서, 이러한 전임상 모델에서 NASH/NAFLD를 검출하기 위해 신뢰할 수 있고, 전염가능하고, 비침습적 이미징 바이오마커에 대한 필요성이 있다. 비침습적 초음파 기반 의 B 모드 이미지와 전단 웨이브 엘라스토그래피 (SWE)는 간 섬유증뿐만 아니라 세포증을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. NASH의 전임상 설치류 모델에서 SWE의 유용성을 평가하기 위해 동물은 프로 NASH 식단에 배치되었고, 비침습적 초음파 B 모드와 전단 파 엘라스토그래피 이미징을 수행하여 간장(HR) 지수와 간 탄력성을 측정하여 NAFLD/NASH 연구를 통해 여러 시간 지점에서 간 지방 축적 및 조직 강성의 진행을 측정했습니다.
HR 지수와 탄성 수치는 스테토시스 및 섬유증의 조직학적 마커와 비교하였다. 결과는 HR 지수와 오일 레드 O (ORO) 염색의 백분율 사이 강한 상관관계를 보여주었습니다, 뿐만 아니라 탄성과 피크로 시리우스 레드 (PSR) 간 염색 사이. 고전적인 전 생체 내 방법과 생체 내 이미징 결과 사이의 강한 상관 관계는 전단 파 엘라스토그래피 / 초음파 기반 이미징이 NAFLD / NASH의 전임상 모델에서 질병 표현형 및 진행을 평가하는 데 사용될 수 있다는 증거를 제공합니다.
Introduction
비알코올성 지방간질환(NAFLD)은 간에서 과도한 지방축적을 특징으로 하는 대사 상태이며, 최근 보고된 글로벌 보급률25%1로전 세계적으로 선도적인 간질환이 되고 있다. 무알코올 성 세포 간염 (NASH)은 NAFLD의 스펙트럼의 더 진행 단계이며, 진보적 인 세포 손상, 염증 및 섬유증을 가진 과잉 간 지방을 특징으로합니다. 이 질병은 환자의 간에서 상당한 손상이 이미 발생할 때까지 혈액 검사 또는 일상적인 검사를 통해 발견되지 않는 종종 침묵합니다. 현재, 환자에서 NASH를 진단하는 금 본위제는 환자 유래 간 생검 샘플의 조직학적 검사를 통해서이다. 유사하게, NASH/NAFLD의 병인뿐만 아니라 약물 개발 산업을 이해하기 위해 일하는 전임상 연구자들은 세포증, 염증 및 섬유증을 측정하기 위해 조직학을 위한 위성 코호트의 간 샘플 또는 말기 안락사의 생체 내 쐐기 생검에 의존합니다.
예를 들어, 간 쐐기 생검은 GUBRA NASH 모델2를사용하는 동안 간 간염과 섬유증을 평가하기 위한 표준 기술이었다. 간 쐐기 생검 방법은 작은 동물3에서침략적이고 힘들다. 연구 결과의 중간에 쐐기 간 생검의 사용은 수시로 필요로 하는 동물의 수를 증가하는 질병 모형에 있는 추가된 실험변수를 나타냅니다. 이러한 요인을 염두에 두고, 초기 시점에서 NASH/NAFLD 동물 모델에서 steatosis및 섬유증을 안정적으로 평가하는 데 사용할 수 있는 비침습적 이미징 기술은 매우 중요합니다. 전단 파 엘라스토그래피 (SWE)는 연조직의 탄성을 측정하는 데 사용되는 초음파 기반 방법입니다. 이 기술은 조직 표적을 향한 초음속 초음파 펄스에 의해 생성된 전단 파의 전파를 측정한 다음 E 계수4라는값을 계산합니다. 전단 파의 속도는 조직 강성의 정도에 비례한다.
도 1 및 도 2는 이미징 영역 설정 및 SWE 계측기를 보여 준다. SWE 계측기는 두 개의 스크린과 그림 2A에표시된 제어판이 있는 단일 휠 유닛입니다. 상부모니터(그림 2B)는컴퓨터 모니터역할을 하며 이미지 및 환자 디렉토리를 표시합니다. 제어판(그림2C)은이미지 캡처의 일반적인 측면을 제어하는 버튼과 다이얼의 배열입니다: 화면 동결, 이미지 저장, 한 모드에서 다른 모드로 변경. 하부화면(그림 2D)은설정을 변경하는 추가 컨트롤이 있는 터치 스크린이며 필요에 따라 데이터를 입력하는 키보드 역할을 합니다. 기기에는 원하는 경우 터치 스크린에 사용할 스타일러스가 장착되어 있습니다. 초음파 프로브는 장치의 하부 전면 패널에 부착됩니다. 설치류의 B 모드 및 SWE 이미징의 경우 초선형 6~20MHz 트랜스듀서가 사용되었습니다. 비침습적으로 조직 강성을 측정하는 이 기능은 SWE를 NASH 환자에서 간 섬유증5의 식별 및 준비에 대한 귀중한 도구로 만들어 더 침습적 인 방법에 대한 필요성을 감소시다. SWE는, 실제로, 환자에서 간 섬유증을 측정하기 위하여 이용되고 진료소 에서 섬유증을 득점하는 FDA 승인한 방법입니다6. SWE를 사용하여 질병의 동물 모델에서 NASH 진행을 모니터링하면 치료 개발을위한 번역 도구를 제공하고 동시에 동물 주체 수의 감소와 통증과 고통을 최소화하기 위한 생체 내 절차의 개선을 통해 동물 복지를 향상시킬 수 있습니다.
인간 환자에서 SWE 이미징은 작은 동물에게 이상적이지 않은 저주파 초음파 트랜스듀서4를사용합니다. 특히, 고주파 SWE 기술은 쥐 모델7에서NASH의 발병에 대한 아세틸-코아 카바실라제 억제의 효능을 평가하기 위해 사용되어 왔으며, 이 기술의 유용성은 전통적인 METAVIR 조직학 채점방법에비해 성공적인 결과를 갖는 간 섬유증의 탄소 테트라클로라이드 쥐 모델에서 기술되었다 8. 그러나, 기존 문헌은 NASH의 전임상 모델에서 SWE 이미징의 적용에 대한 상세한 기술 및 방법론 정보가 부족합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 간 steatosis는 NAFLD/NASH 상태의 주요 특징 의 한개이고 내정간섭이 고려될 수 있는 중요한 단계입니다. 따라서, 이미징 양식증을 사용하여 간 지방 축적을 평가하는 것은 NASH/NAFLD의 전임상 모델에서 간 섬유증을 평가하는 것만큼 중요합니다.
신장 피질의 것과 비교하여 간 조직 밝기의 비율로 알려진 초음파 기술은 클리닉9,10에서스테토시스의 대리 마커로 사용되어 왔다. 그러나 이 접근법은 NAFLD/NASH의 전임상 동물 모델에서 광범위하게 사용되지 않았습니다. 본 기사는 NAFLD/NASH의 콜린 결핍, 고지방 식단(CDAHFD) 쥐 모델에서 각각 간 섬유증 및 스테토시스의 대리 마커로서 의탄성뿐만 아니라 HR 지수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 급속한 steatosis를 유도, 간 염증, 및 섬유증, 마우스에서 6 주 이내에 측정 할 수있습니다 11. 이 규정식에 콜레스테롤 (1%)의 추가는 쥐에 있는 섬유발생을 승진시키기 위하여 보였습니다12,이 모형은 전단 파 화상 진찰을 관련시키는 검증 연구 결과를 위한 적당한 후보 만들기. 전반적으로, 이 화상 진찰 기술은 또한 steatosis 및/또는 섬유증이 관심의 끝점인 NASH 모형/규정식의 넓은 범위에 적용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SWE를 포함하여 초음파 기지를 둔 화상 진찰은, NAFLD/NASH의 전임상 모형에 있는 간 steatosis 및 뻣뻣함의 종방향 평가를 위한 귀중한 공구일 수 있습니다. 이 논문은 NASH의 CDAHFD 다이어트 유도 쥐 모델을 사용하여 HR 지수 및 탄성의 측정을 위한 고품질 B 모드뿐만 아니라 간 SWE 이미지를 획득하는 방법에 대한 상세한 방법론을 설명합니다. 또한, 결과는 간 조직의 평가-조직학적 평가의 금본위제와 HR 지…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 연구 동물의 건강을 돌보고 보장하고 일부 기술을 지원한 화이자 비교 의학 운영 팀에게 감사를 표하고 싶습니다. 또한, 감사는 조직 분석을위한 조직 처리에 대한 자신의 도움에 대한 다니엘 크로웰, 게리 Seitis, 제니퍼 애슐리 올슨에 빚이있다. 또한, 저자는 이 원고를 준비하는 동안 줄리타 라미레즈에게 귀중한 피드백을 검토하고 제공한 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubricatn to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
Referências
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