Usando nanopartículas lipídicas para a entrega de mRNA quimicamente modificado em células de mamíferos

Resumo

O protocolo apresenta transcrição in vitro (IVT) de mRNA quimicamente modificado, preparação de lipossomas catiônicos e análise funcional de transfecções de mRNA habilitadas para lipossomas em células de mamíferos.

Resumo

Nos últimos anos, o RNA mensageiro quimicamente modificado (mRNA) emergiu como uma potente molécula de ácido nucleico para o desenvolvimento de uma ampla gama de aplicações terapêuticas, incluindo uma nova classe de vacinas, terapias de reposição de proteínas e imunoterapias. Entre os vetores de entrega, as nanopartículas lipídicas são consideradas mais seguras e eficazes na entrega de moléculas de RNA (por exemplo, siRNA, miRNA, mRNA) e alguns produtos já estão em uso clínico. Para demonstrar a entrega de mRNA mediada por nanopartículas lipídicas, apresentamos um protocolo otimizado para a síntese de mRNA eGFP modificado por me1Ψ-UTP funcional, a preparação de lipossomas catiônicos, a formação de complexos eletrostáticos de mRNA com lipossomas catiônicos e a avaliação das eficiências de transfecção em células de mamíferos. Os resultados demonstram que essas modificações melhoraram eficientemente a estabilidade do mRNA quando entregues com lipossomas catiônicos e aumentaram a eficiência e a estabilidade da tradução do mRNA do eGFP em células de mamíferos. Este protocolo pode ser usado para sintetizar o mRNA desejado e transfectar com lipossomas catiônicos para expressão gênica alvo em células de mamíferos.

Introdução

Como molécula terapêutica, o mRNA oferece várias vantagens devido à sua natureza não integrativa e sua capacidade de transfectar células não mitóticas quando comparado ao DNA plasmidial (pDNA)¹. Embora a entrega de mRNA tenha sido demonstrada no início da década de 1990, as aplicações terapêuticas foram limitadas devido à sua falta de estabilidade, falta de ativação imunológica e baixa eficiência translacional². Modificações químicas recentemente identificadas, como pseudouridina 5'-trifosfato (Ψ-UTP) e metil pseudouridina 5'-trifosfato (me1Ψ-UTP) no mRNA, ajudaram a superar essas limita....

Protocolo

1. Produção de mRNA modificado me1 Ψ-UTP

1. Preparação do molde de DNA de transcrição in vitro (IVT)
   NOTA: Para a preparação do molde de DNA IVT (promotor T7 - quadro de leitura aberto (ORF) do gene), projete um conjunto de primers específicos do gene para o gene de interesse. Adicione a sequência do promotor T7 (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') antes do primer direto específico do gene.
   1. Prepare a mistura de reação de PCR conforme descrito na Tabela 1.
      NOTA: Execute pelo menos quatro reações de PCR para aumentar a concentração e a qualidade do modelo de DNA IVT para IVT.
   2. Mist....

Resultados

Otimizamos o protocolo para produção de mRNA modificado por me1Ψ-UTP, preparação de lipossomas e experimentos de transfecção de mRNA com lipossomas catiônicos em várias células de mamíferos (Figura 1). Para sintetizar o mRNA, o modelo eGFP IVT otimizado para códons de mamíferos foi amplificado a partir do vetor de expressão de mamíferos mEGFP-N1 e purificado pelo método de extração orgânica / precipitação de etanol (Figura 2). Mais tarde, o RNA e o mRNA modifica.......

Discussão

As aplicações terapêuticas de mRNAs não modificados têm sido limitadas devido à sua meia-vida mais curta e sua capacidade de ativar respostas imunes inatas intracelulares, que por sua vez levam a uma baixa expressão de proteínas em células transfectadas¹¹. Katalin et al. demonstraram que o RNA contendo nucleosídeos modificados, como m5C, m6A, ΨU e me1Ψ-UTP, poderia evitar a ativação de TLR¹². Mais importante, a incorporação de ΨU ou me1Ψ-UT.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Lonza	50004
Sonicador de banho	DNMANM Industries	USC-100
Lipídio catiônico	sintetizado no laboratório
Clorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Cuidado"
Colesterol	Himedia	GRM335
DEPC água	SRL BioLit	66886
Escada de DNA DMEM	Lonza	12-604F
GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sal de sódio	MP biomedicals	194822
Etanol	Hayman	F204325	"Cuidado"
Soro bovino fetal	Gibco	10270
Citometria de fluxo	BD	FACS Celesta
Microscópio de Fluroscência	Leica	MI6000B
Sistema de documentação em gel	Cell Biosciences	Flurochem E
Ácido acético glacial	Fisher Scientific	85801	"Cuidado"
mEGFP-N1, vetor de expressão de mamíferos	Addgene	54767
N1-Metilpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Fenol: clorofórmio: isoamil alcol (25: 24: 1), pH 8,0	SRL BioLit	136112-00-0	"Cuidado"
Tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4	Sonda CellClone	CC3041
Sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
Escada de RNA	NEB	N0362S
Inibidor de RNase	Thermo Scientific	N8080119
SafeView corante	abm	G108
Acetato de sódio	Sigma	S7545
Termociclador	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Tripsina	Gibco	25200056