Mancha imunofluorescente para visualização de proteínas associadas à heterocromatina em glândulas salivares drosophila

Summary

Este protocolo visa visualizar agregados de heterocromatina em células de politento de Drosophila.

Abstract

A visualização dos agregados de heterocromatina por imunostaining pode ser desafiadora. Muitos componentes mamíferos da cromatina são conservados em Drosophila melanogaster. Portanto, é um excelente modelo para estudar a formação e manutenção da heterocromatina. Células politenizadas, como as encontradas nas glândulas salivares da terceira instar D. melanogaster larvas, fornecem uma excelente ferramenta para observar a cromatina amplificada quase mil vezes e permitiram aos pesquisadores estudar mudanças na distribuição de heterocromatina no núcleo. Embora a observação dos componentes da heterocromatina possa ser realizada diretamente nas preparações cromossômicas de politento, a localização de algumas proteínas pode ser alterada pela gravidade do tratamento. Portanto, a visualização direta da heterocromatina nas células complementa esse tipo de estudo. Neste protocolo, descrevemos as técnicas de imunossuagem utilizadas para este tecido, o uso de anticorpos fluorescentes secundários e a microscopia confocal para observar esses agregados de heterocromatina com maior precisão e detalhe.

Introduction

Desde os primeiros estudos de Emil Heitz¹, a heterocromatina tem sido considerada um importante regulador de processos celulares, como expressão genética, separação meiomática e mitótica de cromossomos, e a manutenção da estabilidade do genoma^2,3,4.

A heterocromatina é dividida principalmente em dois tipos: heterocromatina constitutiva que define caracteristicamente sequências repetitivas, e elementos transposáveis que estão presentes em locais específicos do cromossomo, como os telômeros e os centrosmers. Este tipo de heter....

Protocol

1. Terceira cultura de larvas instar

1. Prepare 1 litro de mídia padrão adicionando 100 g de levedura, 100 g de açúcar de cana inteiro não refinado, 16 g de ágar, 10 mL de ácido propiônico e 14 g de gelatina. Dissolva todos os ingredientes, exceto o fermento em 800 mL de água da torneira e, em seguida, dissolva a levedura. Autoclave imediatamente por 30 minutos.
   1. Depois, deixe a mídia esfriar até 60 °C e adicione ácido propiônico a uma concentração final de 0,01%. Deixe a garrafa ficar de pé até que a gelatina seja formada.
2. Para otimizar a cultura das larvas 3o instar, primeiro colete adultos idosos de 5 a 10 dias e coloque 50 (25 ....

Results

Resultados representativos da imunostaining HP1A nas glândulas salivares de Drosophila são mostrados na Figura 1. Um resultado positivo é observar um ponto focal (Figura 1a) (agregado heterocromático ou condensado). Um resultado negativo não é sinal ou sinal disperso. Às vezes, um sinal duplo pode ser observado, ou seja, com um ponto duplo(Figura 1c),mas geralmente ocorre em quantidades menores.

.......

Discussion

A função celular dos organismos eucarióticos pode definir a estrutura 3D dentro do núcleo, que é suportada por interações entre diferentes proteínas com cromatina e várias moléculas, incluindo RNA. Nos últimos três anos, os condensados biológicos que tiveram relevância, incluindo a heterocromatina, assumiram um papel fundamental na determinação da separação de fases promovendo a distinta organização espacial nuclear da cromatina ativa e repressiva ^16,17,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Axygen MCT-150-C	marca 11351904	não crítica
16% formaldeído	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Grau de Biologia Molecular	Marca Roche	10735078001	não crítica
Inibidores de protease completos Ultra livre de EDTA protease inibidores	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marca não crítica
DTT	Sigma	d9779	marca não crítica
EDTA	Sigma	E5134	marca não crítica
EGTA			marca não crítica
Lâmina de vidro	Selo	dourado 3011	marca não crítica
H3BO3	Baker	0084-01	marca não crítica
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Forma do Produto  Concentrado 0,1 mL
KCl	Baker	3040-01	marca não crítica
Metanol	Baker	9070-03	marca não crítica
NaCl	Sigma	71376	marca não crítica
NaOH			marca não crítica
PIPES			marca não crítica
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Agitador de Tubo Labquake
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	marca não crítica
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marca não crítica
β-mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, marca não crítica