드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

Summary

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

Abstract

면역 염색에 의한 이종로크로마틴 골재의 시각화는 어려울 수 있습니다. 크로마틴의 많은 포유류 성분은 드로소필라 멜라노가스터에 보존된다. 따라서 이종로크로마티닌 형성 및 유지보수를 연구하는 우수한모델이다. 제3의 별D. 멜라노가스터 유충의 타액선에서 발견되는 것과 같은 다각화된 세포는 크로마틴을 거의 천 번 증폭시키는 것을 관찰하는 훌륭한 도구를 제공하고 연구자들은 핵에서 이종로크로마틴의 분포변화를 연구할 수 있게 하였다. 이종염색로마티신 성분의 관찰은 폴리텐 염색체 제제에서 직접 수행될 수 있지만, 일부 단백질의 국소화는 치료의 중증도에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 세포에서 이종로크로마틴의 직접적인 시각화는 이러한 유형의 연구를 보완한다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 조직에 사용된 면역 염색 기술, 이차 형광 항체의 사용 및 더 중대한 정밀도 및 세부사항으로 이 이 이종로막골을 관찰하기 위하여 공초점 현미경 검사법을 기술합니다.

Introduction

에밀 헤이츠^1의초기 연구 이후, 이종학은 염색체의 유전자 발현, 메이오틱 및 미토틱 분리, 게놈 안정성^2,3,4의 유지 와 같은 세포 과정의 중요한 레귤레이터로 간주되었다.

이종로크로마티닌은 주로 반복적인 시퀀스를 정의하는 구성이종, 텔로미어 및 원로메머와 같은 특정 염색체 부위에 존재하는 전이 가능한 요소의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 이 종족의 이종은 주로 히스톤 H3(H3K9me3)의 리신 9의 디 또는 트라이메틸화와 헤테로크로마티틴 단백질 1a(HP1a)^5,6의결합과 같은 특정 히스톤 마크에 의해 후성유전학적으로 정의된다. 한편, 이종은 염색체의 팔을 통해 국소화되며 주로 발달침묵유전자^7,8로구성된다. 전상 세포에서 이종로크로마틴 블록의 면역 염색, 또는 단계 간 세포에서 이종로크로마티닌 골재의 관찰, 이종학 영역9의 형성 및기능에 대한 이해에 많은 빛을 공개했다.

드로소필라를 모델 시스템으로 사용하면 전자 현미경^{검사법(10)을}사용하지 않고 이종로크로마티닌을 연구할 수 있는 필수 도구의 개발이 허용되었다. 위치 효과 의 설명 다양화 및 HP1a와 같은 이종로크로마틴 관련 단백질의 발견 이후, 많은 그룹은 이러한 이종 영역의 시각화를 허용하는 여러 면역 조직 화학 적 기술을^{개발했다 10,11.}

이러한 기술은 이종로크로마틴 관련 단백질 또는 히스톤 마크를 인식하는 특정 항체의 사용에 기초한다. 모든 세포 유형 및 항체에 대해 고정 및 투과성 조건은 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한 스쿼싱 기술과 같은 추가 기계적 공정이 사용되는 경우 조건이 다를 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이종적 인 포시를 공부하기 위해 Drosophila 타액 땀샘의 사용을 설명합니다. 살리보리 땀샘은 게놈의 1,000부 이상을 포함하는 다원화 세포를 가지고 있어, 따라서 위성 DNA와 복제되는 일부 이종 영역을 제외하고 대부분의 크로마틴 특징에 대한 증폭된 전망을 제공한다. 그럼에도 불구하고 이종염색체 영역은 폴리텐 염색체 제제로 쉽게 시각화되지만 스쿼시 기술은 때때로 특징적인 크로마틴 바운드 복합체 또는 크로마틴 아키텍처를 방해할 수 있습니다. 따라서 침선 조직 전체에서 단백질의 면역 지역화는 이러한 원치 않는 효과를 능가할 수 있습니다. 우리는 몇몇 크로마틴 바운드 단백질을 검출하기 위하여 이 프로토콜을 이용하고, 우리는 돌연변이 Drosophila 주식과 결합된 이 프로토콜이 이종로크로마틴 중단^12를연구하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다.

Protocol

1. 제3회 인스타 애벌레 문화 효모 100g, 정제되지 않은 통지팡이 설탕 100g, 한천 16g, 프로피오닉산 10mL, 젤라틴 14g을 추가하여 표준 미디어 1리터를 준비합니다. 효모를 제외한 모든 재료를 수돗물 800mL에 녹인 다음 효모를 녹입니다. 즉시 30분 동안 오토클레이브. 그 후, 미디어를 60°C로 식히고 최종 농도0.01%에 프로피오닉산을 첨가하게 한다. 젤라틴이 형성될 때까지 병을 방치하십시오….

Representative Results

드로소필라 타액선에서 HP1a 면역염색의 대표적인 결과가 도 1에도시된다. 긍정적인 결과는 하나의 초점(도1a)(이종골골재 또는 응축수)을 관찰하는 것이다. 음의 결과는 신호나 분산된 신호가 아닙니다. 때로는 이중 신호를 관찰 할 수 있습니다, 즉, 이중 점(도 1c)와함께, 그러나 일반적으로 작은 양에서 발생합니다. <p cla…

Discussion

진핵 생물의 세포 기능은 크로마티닌과 RNA를 포함한 다양한 분자와의 상호 작용에 의해 지원되는 핵 내의 3D 구조를 정의할 수 있다. 지난 3년 동안 이종로크로마틴을 포함한 관련성이 있는 생물학적 응축수들은 활성 및 억압적인 크로마틴 ^16,17,18의뚜렷한 핵 공간 조직을 촉진하는 위상 분리 의 결정에 근본적인 역할을^{수행했다.</su…}

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical