A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.
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Artigo de método
Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-traducional (PTM) generalizada de proteínas envolvida na regulação de várias vias celulares, incluindo processamento de RNA, transdução de sinal, resposta a danos no DNA, biogênese de miRNA e tradução.
Nos últimos anos, graças aos desenvolvimentos bioquímicos e analíticos, a proteômica baseada em espectrometria de massa (EM) emergiu como a estratégia mais eficaz para caracterizar o metilproteoma celular com resolução de sítio único. No entanto, a identificação e o perfil da R-metilação da proteína in vivo pela EM continuam a ser desafiantes e propensos a erros, principalmente devido à natureza subestequiométrica desta modificação e à presença de várias substituições de aminoácidos e metil-esterificação química de resíduos ácidos que são isobáricos à metilação. Assim, são necessários métodos de enriquecimento para melhorar a identificação de peptídeos-R-metil e estratégias de validação ortogonal para reduzir as Taxas de Falsa Descoberta (FDR) em estudos de metilproteômica.
Aqui, um protocolo projetado especificamente para identificação e quantificação de peptídeos R-metil de alta confiança a partir de amostras celulares é descrito, que combina marcação metabólica de células com metionina codificada em isótopos pesados (hmSILAC) e digestão em solução de protease dupla de extrato de célula inteira, seguida por fracionamento de cromatografia off-line de fase reversa de pH alto (HpH-RP) e enriquecimento de afinidade de peptídeos R-metil usando anticorpos anti-pan-R-metil. Após a análise de MS de alta resolução, os dados brutos são primeiro processados com o pacote de software MaxQuant e os resultados são então analisados pelo hmSEEKER, um software projetado para a pesquisa aprofundada de pares de pico MS correspondentes ao peptídeo metil leve e pesado dentro dos arquivos de saída MaxQuant.
Introdução
A arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional (PTM) que decora cerca de 1% do proteomade mamíferos 1. A proteína arginina metiltransferases (PRMTs) são as enzimas que catalisam a reação de R-metilação pela deposição de um ou dois grupos metil aos átomos de nitrogênio (N) do grupo guanidino da cadeia lateral de R de maneira simétrica ou assimétrica. Em mamíferos, os PRMTs podem ser agrupados em três classes - tipo I, tipo II e tipo III - dependendo de sua capacidade de depositar monometilação (MMA) e dimetilação assimétrica (ADMA), MMA e dimetilação simétrica (SDMA) ou apenas MMA, respectivamente 2,3
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Protocolo
1. Cultura celular e extração de proteínas (tempo: 3 - 4 semanas necessárias)
- Cultivar células HeLa em paralelo em meios fornecidos com metionina leve (L) ou pesada (H), respectivamente (ver Tabela 1 para composição de meios). Após pelo menos oito divisões celulares, coletar uma alíquota de células de cada canal SILAC e realizar o teste de incorporação.
NOTA: Para verificar a eficiência de incorporação, teste por análise LC-MS/MS que a porcentagem de metionina pesada (Met-4) no canal pesado é o mais próximo possível de 100%. Analise uma alíquota de células fortemente marcadas por LC-MS/MS (para configurações, consulte a Tabela 2
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Resultados
O artigo descreve um fluxo de trabalho para a identificação de alta confiança da proteína R-metilação global, que se baseia na combinação da digestão enzimática do extrato proteico com duas proteases distintas em paralelo, seguida pelo fracionamento por cromatografia líquida de peptídeos proteolíticos HpH-RP e enriquecimento por imuno-afinidade de peptídeos R-metil com anticorpos anti-pan-R-metil (Figura 1).
As células foram cultivadas na presença de Metionina, na.......
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Discussão
A identificação de alta confiança da metilação de proteínas/peptídeos in vivo por proteômica global baseada em EM é um desafio, devido ao risco de alta FDR, com várias substituições de aminoácidos e metilesterificação ocorrendo durante o preparo da amostra que são isobáricas à metilação e podem causar atribuições erradas na ausência de estratégias ortogonais de validação da EM. A natureza subestequiométrica desse PTM complica ainda mais a tarefa da metilproteômica global, mas pode ser superada com o enriquecimen.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
MM e EM são estudantes de doutoramento da Escola Europeia de Medicina Molecular (SEMM). O EM é o destinatário de uma bolsa FIRC-AIRC de 3 anos (Código do Projeto: 22506). As análises globais de R-metil-proteomas no grupo TB são apoiadas pelo AIRC IG Grant (Código do Projeto: 21834).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bicarbonato de amônio (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Persulfato de amônio (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak colunas vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Coloração coloidal de Coomassie Instantâneo | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, | Roche-Sigma Aldrich | sem EDTA11836170001 | Inibidor de Protease |
| Diallisado Fetal Soro Bovino (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Médio | GIBCO ThermoFisher | solicitado | com glutamina estável e sem metionina |
| Sistema de cromatografia EASY-nano LC 1200 | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray Colunas HPLC | ThermoFisher | ES907 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Células HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamida (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Júpiter C12-RP coluna | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Metionina | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Metionina |
| L-Metionina-(metil-13C, d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Metionina |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Sonifier Disruptor de Células Microtip 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′ -Tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicilina-Estreptomicina | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| Inibidor de Fosfatase | PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 |
| Pontas Pierce C18 | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Ácido Fórmico (v/v) em Acetonitrila, Grau | LC-MSThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvente B |
| Pierce 0.1% Ácido Fórmico (v/v) em Água, Grau LC-MS | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvente A |
| Pierce Acetonitrila (ACN), Grau LC-MS | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Água, Grau LC-MS | ThermoFisher | 51140 | |
| Poliacrilamida | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein Todos os padrões de proteína pré-fabricada azul | Anticorpos Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan anticorpos α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan anticorpos α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Espectrômetro | ThermoFisher | ||
| Grau de Sequenciamento Modificado Tripsina | Promega | V5113 | |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Ureia | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Concentrador de Vácuo 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Referências
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
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Reimpressões e permissões
