Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse
Summary
Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.
Abstract
Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide eiwit post-translationele modificatie (PTM) die betrokken is bij de regulatie van verschillende cellulaire routes, waaronder RNA-verwerking, signaaltransductie, DNA-schaderespons, miRNA-biogenese en translatie.
In de afgelopen jaren, dankzij biochemische en analytische ontwikkelingen, is massaspectrometrie (MS) -gebaseerde proteomics naar voren gekomen als de meest effectieve strategie om het cellulaire methyl-proteoom te karakteriseren met single-site resolutie. Het identificeren en profileren van in vivo eiwit R-methylatie door MS blijft echter uitdagend en foutgevoelig, voornamelijk vanwege de substoichiometrische aard van deze modificatie en de aanwezigheid van verschillende aminozuursubstituties en chemische methylverestering van zure residuen die isobaar zijn voor methylering. Daarom zijn verrijkingsmethoden nodig om de identificatie van R-methylpeptiden te verbeteren en orthogonale validatiestrategieën om False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics-studies te verminderen.
Hier wordt een protocol beschreven dat specifiek is ontworpen voor de identificatie en kwantificering van R-methylpeptiden met hoge betrouwbaarheid uit cellulaire monsters, dat metabole etikettering van cellen koppelt met zware isotoop-gecodeerde Methionine (hmSILAC) en dubbele protease-in-oplossing vertering van hele celextract, gevolgd door off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatografiefractionering en affiniteitsverrijking van R-methyl-peptiden met behulp van anti-pan-R-methylantistoffen. Bij ms-analyse met hoge resolutie worden ruwe gegevens eerst verwerkt met het MaxQuant-softwarepakket en de resultaten worden vervolgens geanalyseerd door hmSEEKER, een software die is ontworpen voor het diepgaand zoeken naar MS-piekparen die overeenkomen met lichte en zware methylpeptiden in de MaxQuant-uitvoerbestanden.
Introduction
Arginine (R)-methylatie is een posttranslationele modificatie (PTM) die ongeveer 1% van het zoogdierproteoom1 versiert. Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) zijn de enzymen die de R-methylatiereactie katalyseren door de afzetting van een of twee methylgroepen naar de stikstof (N) atomen van de guanidinogroep van de zijketen van R op een symmetrische of asymmetrische manier. Bij zoogdieren kunnen PRMT’s worden gegroepeerd in drie klassen – type I, type II en type III – afhankelijk van hun vermogen om zowel monomethylatie (MMA) als asymmetrische dimethylatie (ADMA), MMA en symmetrische dimethylatie (SDMA) of alleen MMA te deponeren, respectievelijk 2,3. PRMT’s richten zich voornamelijk op R-residuen in glycine- en argininerijke regio’s, bekend als GAR-motieven, maar sommige PRMT’s, zoals PRMT5 en CARM1, kunnen proline-glycine-methionine-rijke (PGM) motievenmethylaaten 4. R-methylatie is naar voren gekomen als een eiwitmodulator van verschillende biologische processen, zoals RNA-splicing5, DNA-reparatie6, miRNA-biogenese7 en translatie2, waardoor het onderzoek naar deze PTM wordt bevorderd.
Massaspectrometrie (MS) wordt erkend als de meest effectieve technologie om systematisch wereldwijde R-methylatie te bestuderen met eiwit-, peptide- en site-resolutie. Deze PTM vereist echter enkele bijzondere voorzorgsmaatregelen voor de zeer betrouwbare identificatie door de lidstaten. Ten eerste is R-methylatie substoichiometrisch, waarbij de ongewijzigde vorm van de peptiden veel overvloediger is dan de gemodificeerde, zodat massaspectrometers die in de Data Dependent Acquisition (DDA) -modus werken, vaak onmodificeerde peptiden met hoge intensiteit zullen fragmenteren dan hun gemethyleerde tegenhangers met lagere intensiteit8. Bovendien lijden de meeste MS-gebaseerde workflows voor R-gemethyleerde site-identificatie aan beperkingen op het niveau van bio-informaticaanalyse. Inderdaad, de computationele identificatie van methylpeptiden is gevoelig voor hoge False Discovery Rates (FDR), omdat deze PTM isobaar is voor verschillende aminozuursubstituties (bijv. Glycine in alanine) en chemische modificatie, zoals methylverestering van aspartaat en glutamaat9. Vandaar dat methoden op basis van de isotoopetikettering van methylgroepen, zoals Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), zijn geïmplementeerd als orthogonale strategieën voor zelfverzekerde MS-identificatie van in vivo methylaties, waardoor de snelheid van fout-positieve annotaties aanzienlijk wordt verminderd10.
Onlangs zijn verschillende proteoombrede protocollen voor het bestuderen van R-gemethyleerde eiwitten geoptimaliseerd. De ontwikkeling van op antilichamen gebaseerde strategieën voor de immunoaffiniteitsverrijking van R-methylpeptiden heeft geleid tot de annotatie van enkele honderden R-gemethyleerde sites in menselijke cellen11,12. Bovendien meldden veel studies 3,13 dat het koppelen van op antilichamen gebaseerde verrijking met peptidescheidingstechnieken zoals HpH-RP chromatografiefractionering het totale aantal geïdentificeerde methylpeptiden kan verhogen.
Dit artikel beschrijft een experimentele strategie ontworpen voor de systematische en zeer betrouwbare identificatie van R-gemethyleerde locaties in menselijke cellen, gebaseerd op verschillende biochemische en analytische stappen: eiwitextractie uit hmSILAC-gelabelde cellen, parallelle dubbele enzymatische spijsvertering met Trypsine en LysargiNase proteasen, gevolgd door HpH-RP chromatografische fractionering van verteerde peptiden, gekoppeld aan op antilichamen gebaseerde immuno-affiniteitsverrijking van MMA-, SDMA-, en ADMA-bevattende peptiden. Alle affiniteitsverrijkte peptiden worden vervolgens geanalyseerd door hoge-resolutie vloeistofchromatografie (LC) -MS / MS in DDA-modus, en ruwe MS-gegevens worden verwerkt door het MaxQuant-algoritme voor identificatie van R-methylpeptiden. Ten slotte worden de MaxQuant-uitvoerresultaten verwerkt met hmSEEKER, een in eigen huis ontwikkelde bioinformatica-tool om paren van zware en lichte methylpeptiden te zoeken. In het kort leest en filtert hmSEEKER methylpeptidenidentificaties uit het msms-bestand, vergelijkt vervolgens elk methylpeptide met de overeenkomstige MS1-piek in het allPeptides-bestand en zoekt ten slotte de piek van de zware / lichte peptide-tegenhanger. Voor elk vermeend zwaar-lichtpaar worden de parameters Log2 H/L-verhouding (LogRatio), Retentietijdverschil (dRT) en Massafout (ME) berekend en doubletten die zich binnen door de gebruiker gedefinieerde cut-offs bevinden, worden gelabeld als echte positieven. De workflow van het biochemische protocol is beschreven in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
De identificatie met hoge betrouwbaarheid van in vivo eiwit/peptidemethylatie door wereldwijde ms-gebaseerde proteomics is een uitdaging, vanwege het risico op hoge FDR, met verschillende aminozuursubstituties en methylverestering die optreden tijdens de monstervoorbereiding die isobaar zijn voor methylatie en verkeerde toewijzingen kunnen veroorzaken bij afwezigheid van orthogonale MS-validatiestrategieën. De substoichiometrische aard van deze PTM bemoeilijkt de taak van wereldwijde methylproteomica verder, ma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM en EM zijn promovendi binnen de European School of Molecular Medicine (SEMM). EM is de ontvanger van een 3-jarige FIRC-AIRC-beurs (Projectcode: 22506). Globale analyses van R-methyl-proteomen in de TB-groep worden ondersteund door de AIRC IG Grant (ProjectCode: 21834).
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Referências
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
