Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.
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Artigo de método
Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio
Neste artigo
Resumo
Resumo
A retinopatia induzida por oxigênio (OIR) é amplamente utilizada para estudar o crescimento anormal de vasos em doenças isquêmicas da retina, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), retinopatia diabética proliferativa (RDR) e oclusão da veia retinista (RVO). A maioria dos estudos de OIR observa a neovascularização da retina em pontos de tempo específicos; no entanto, o crescimento dinâmico de embarcações em camundongos vivos ao longo de um curso de tempo, essencial para a compreensão das doenças de vasos relacionadas ao OIR, tem sido subestudado. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para a indução do modelo de mouse OIR, destacando as potenciais armadilhas, e fornecendo um método aprimorado para quantificar rapidamente áreas de vaso-obliteração (VO) e neovascularização (NV) usando coloração de imunofluorescência. Mais importante, monitoramos o recrescimento de embarcações em camundongos vivos de P15 a P25 realizando angiografia de fundus fluoresceína (FFA) no modelo de mouse OIR. A aplicação da FFA ao modelo de mouse OIR nos permite observar o processo de remodelação durante o recrescimento da embarcação.
Introdução
A neovascularização da retina (RNV), que é definida como um estado onde novos vasos patológicos se originam das veias retinárias existentes, geralmente se estende ao longo da superfície interna da retina e cresce no espaço vítreo (ou subretral sob algumas condições)1. É uma característica marcante e comum de muitas retinopatias isquêmicas, incluindo retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão da veia da retina (RVO) e retinopatia diabética proliferativa (PDR)2.
Inúmeras observações clínicas e experimentais indicaram que a isquemia é a principal causa da neovascularizaçãoda re....
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo o uso de camundongos foram aprovados pelo comitê de ética experimental animal do Centro Oftalmológico de Zhongshan, Sun Yat-sen University, China (número autorizado: 2020-082), e de acordo com as diretrizes aprovadas do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro Oftalmológico de Zhongshan e da Declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visão.
1. Indução do modelo OIR do mouse
- Use camundongos com uma taxa mais baixa de malformação congênita dos olhos, por exemplo, camundongos C57BL/6J, e acasale-os em uma proporção de mac....
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Resultados
No modelo de mouse OIR, o resultado mais importante e básico é a quantificação da área de VO e NV. Depois de viver no ambiente de hiperoxia por 5 dias a partir de P7, a retina central dos filhotes apresentou a maior área de não perfusão. Sob a estimulação da hipóxia em mais 5 dias, a neovascularização da retina foi gradualmente produzida, que fluoresced mais intensamente do que vasos normais circundantes. Após P17, o sinal de fluorescência da neovascularização patológica regrediu rapidamente como a remodelagem da retina .......
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Discussão
A suscetibilidade dos camundongos ao OIR é afetada por muitos fatores. Os filhotes de diferentes origens genéticas e cepas não podem ser comparados. Em camundongos albinos BALB/c, os vasos recrescem rapidamente na área de VO com tufos neovasculares reduzidos significativos38, que trazem algumas dificuldades para a pesquisa. Em camundongos C57BL/6, há aumento do dano do fotoreceptor quando comparado com a cepa de rato BALB/cJ39,40. O mesmo .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a todos os membros do nosso laboratório e laboratório de animais oftalmológicos do Centro Oftalmológico Zhongshan por sua assistência técnica. Agradecemos também ao Prof. Chunqiao Liu pelo apoio experimental. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (NSFC: 81670872; Pequim, China), a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (Grant No.2019A1515011347), e projeto de construção hospitalar de alto nível do Laboratório Estadual de Oftalmologia do Centro Oftalmológico Zhongshan (Grant No. 303020103; Guangzhou, Província de Guangdong, China).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa estéril de 1 mL | Solarbio | YA0550 | Para preparação de montagens planas de retina e injeção intraperitoneal |
| 1× Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | Para preparação de montagens planas de |
| retina Tubo de microcentrífuga de 2 ml | Corning | MCT-200-C | Para preparação de montagens planas de retina |
| 48 Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de poço Corning | 3548 | Para preparação de montagens planas de retina | |
| Lâminas de microscópio adesivas | Vários | Para preparação de montagens planas de retina | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | Para análise de imagem | |
| Gás dióxido de carbono | Vários | Para sacrifício | |
| Lâmina de cobertura | Vários | Para preparação de montagens planas de retina | |
| Fórceps curvas | World Precision Instruments | 14127 | Para preparação de montagens planas de retina |
| Solução de coloração DAPI | Abcam ab228549 | Para rotular o núcleo em montagens planas de retina | |
| Microscópio de dissecação | Olmpus | SZ61 | Para preparação de montagens planas de retina |
| Fluoresceína sódica | Sigma-Aldrich | F6377 | Para imagens in vivo |
| Microscópio Fluorescente | Zeiss | AxioImager.Z2 | Para aquisição de imagens de fluorescência de suportes planos de retina |
| Fluoromount-G Mídia de montagem | SouthernBiotech | 0100-01 | Para a preparação de montagens planas de retina |
| Hidroxipropilmetilcelulose | Maya | 89161 | Para imagens in vivo |
| Isolectina B4 594 anticorpo | Invitrogen | I21413 | Para rotular a vasculatura retiniana em montagens planas de retina |
| Camundongos C57/BL6J | GemPharmatech da província | Para indução do modelo OIR | |
| Micro dissecação lâmina reta de tesoura | World Precision Instruments | 503242 | Para preparação de montagens planas de retina |
| Pinça reta nº 4 World | Precision Instruments | 501978-6 | Para a preparação de montagens planas de retina |
| Soro de burro normal | Abcam | ab7475 | Para preparação de montagens planas de retina |
| Sensor O2 | Vários | Para monitorar o nível de O2 | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | Para indução de modelo OIR |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Para fixação tecidual |
| Pentobarbital sódico | Vários | Para anestesia | |
| Cal sodótica | Vários | Para absorver o excesso de CO2 na câmara de oxigénio | |
| SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | Para in vivo imagiologia |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | Para análise estatística | |
| Agitador de declor Tansference | Kylin-Bell | ZD-2008 | Para preparação de montagens planas de retina Placa de cultura de |
| tecidos (Fixação baixa) | Corning | 3261-20EA | Para preparação de montagens planas de retina Pipetas |
| de transferência | Vários | Para preparação de montagens planas de retina | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | Para a preparação de montagens planas de retina |
| Tropicamida | Vários | Para imagens in vivo | |
| ZEN Imaging Software | ZEISS | Para aquisição e exportação de imagens |
Referências
- Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (20....
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Reimpressões e permissões
