Мониторинг динамического роста сосудов сетчатки в мышиной модели инсулин-индуцированной ретинопатии

Summary

Этот протокол описывает подробный метод приготовления и иммунофлуоресцентного окрашивания мышей с плоскими креплениями и анализа. Также подробно описано использование флуоресцеиновой ангиографии глазного дна (FFA) для детенышей мышей и обработка изображений.

Abstract

Кислород-индуцированная ретинопатия (OIR) широко используется для изучения аномального роста сосудов при ишемических заболеваниях сетчатки, включая ретинопатию недоношенных (РН), пролиферативную диабетическую ретинопатию (PDR) и окклюзию вен сетчатки (RVO). В большинстве исследований OIR наблюдается неоваскуляризация сетчатки в определенные моменты времени; однако динамический рост сосудов у живых мышей в течение определенного времени, который необходим для понимания заболеваний сосудов, связанных с OIR, был недостаточно изучен. Здесь мы описываем пошаговый протокол для индукции мышиной модели OIR, выделяя потенциальные подводные камни и предоставляя улучшенный метод для быстрой количественной оценки областей вазооблитерации (VO) и неоваскуляризации (NV) с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Что еще более важно, мы контролировали возобновление роста сосудов у живых мышей от P15 до P25, выполняя флуоресцеиновую ангиографию глазного дна (FFA) в мышиной модели OIR. Применение FFA к мышиной модели OIR позволяет наблюдать процесс ремоделирования во время роста сосудов.

Introduction

Неоваскуляризация сетчатки (РНВ), которая определяется как состояние, при котором новые патологические сосуды возникают из существующих вен сетчатки, обычно простирается вдоль внутренней поверхности сетчатки и прорастает в стекловидное тело (или субретинальное пространство при некоторых условиях)¹. Это отличительная черта и общая черта многих ишемических ретинопатий, включая ретинопатию недоношенных (РН), окклюзию вен сетчатки (RVO) и пролиферативную диабетическую ретинопатию (PDR)².

Многочисленные клинические и экспериментальные наблюдения показали, что ишемия является основной причиной неоваскуляризации сетчатки ^3,4. При РН новорожденные подвергаются воздействию кислорода высокого уровня в закрытых инкубаторах для повышения выживаемости, что также является важным фактором для остановки роста сосудов. После того, как лечение сделано, сетчатка новорожденных испытывает относительно гипоксический период⁵. Другие ситуации наблюдаются при окклюзии центральных или ветвистых вен сетчатки в RVO, а также наблюдается повреждение капилляров сетчатки, которое вызвано микроангиопатией в PDR². Гипоксия дополнительно увеличивает экспрессию ангиогенных факторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) через сигнальный путь, вызванный гипоксией фактор-1α (HIF-1α), который, в свою очередь, направляет эндотелиальные клетки сосудов для роста в гипоксическую область и образования новых сосудов ^6,7.

РН является разновидностью сосудистой пролиферативной ретинопатии у недоношенных детей и ведущей причиной детской слепоты ^8,9, для которой характерны гипоксия сетчатки, неоваскуляризация сетчатки и фиброзная гиперплазия 10,11,12. В 1950-х годах исследователи обнаружили, что высокая концентрация кислорода может значительно улучшить респираторные симптомы недоношенных детей^13,14. В результате кислородная терапия все чаще применялась у недоношенных детей в то время¹⁵ лет. Однако, одновременно с широким использованием кислородной терапии у недоношенных детей, заболеваемость РН увеличивалась с каждым годом. С тех пор исследователи связали кислород с РН, изучая различные животные модели, чтобы понять патогенез РН и РНВ¹⁶.

У человека большая часть развития сосудистой системы сетчатки завершается до рождения, в то время как у грызунов сосудистая система сетчатки развивается после рождения, обеспечивая доступную модельную систему для изучения ангиогенеза в сосудистой системе сетчатки². С непрерывным прогрессом исследований модели кислород-индуцированной ретинопатии (OIR) стали основными моделями для имитации патологического ангиогенеза в результате ишемии. В исследовании модели OIR нет конкретных видов животных, и модель была разработана для различных видов животных, включая котенка¹⁷, крысу¹⁸, мышь¹⁹, щенка бигля²⁰ и рыбку данио²¹. Все модели имеют один и тот же механизм, с помощью которого они подвергаются гипероксии во время раннего развития сетчатки, а затем возвращаются в нормоксическую среду. Смит и др. отметили, что подвергание детенышей мышей гипероксии от Р7 в течение 5 дней индуцировало крайнюю форму регрессии сосудов в центральной сетчатке и возвращение их в комнатный воздух при Р12 постепенно вызывало неоваскулярные пучки, которые росли к стекловидному телу¹⁹. Это была стандартизированная модель мыши OIR, также называемая моделью Смита. Connor et al. дополнительно оптимизировали протокол и предоставили универсально применимый метод количественной оценки области VO (vaso-obliteration) и NV (неоваскуляризация) в 2009 году, что увеличило принятие и использование модели²². Модель мыши OIR по-прежнему является наиболее широко используемой моделью в настоящее время из-за ее небольшого размера, быстрого размножения, четкого генетического фона, хорошей повторяемости и высокого уровня успеха.

У мышей васкуляризация сетчатки начинается после рождения с врастанием сосудов от головки зрительного нерва во внутреннюю сетчатку к ora serrata. Во время нормального развития сетчатки первые сосуды сетчатки прорастают из головки зрительного нерва вокруг рождения, образуя расширяющуюся сеть (первичное сплетение), которая достигает периферии вокруг постнатального дня 7 (P7) ²³. Затем сосуды начинают расти в сетчатку, образуя глубокий слой, проникая в сетчатку и создавая ламинарную сеть вокруг внутреннего ядерного слоя (INL), как у человека²⁴. К концу третьей постнатальной недели (Р21) развитие более глубокого сплетения почти завершено. Для мышиной модели OIR сосудистая окклюзия всегда появляется в центральной сетчатке из-за быстрой дегенерации большого количества незрелых сосудистых сетей в центральной области во время воздействия гипероксии. Так, рост патологической неоваскуляризации происходит и в средне периферической сетчатке, которая является границей неперфузионной области и сосудистой области. Однако сосуды сетчатки человека почти сформировались еще до рождения. Что касается недоношенных детей, то периферическая сетчатка не полностью васкуляризуется при воздействии гипероксии^25,26. Так окклюзия сосудов и неоваскуляризация в основном появляются в периферической сетчатке^27,28. Несмотря на эти различия, мышиная модель OIR точно повторяет патологические события, которые происходят во время неоваскуляризации, вызванной ишемией.

Индукцию модели OIR можно разделить на две фазы²⁹: в фазе 1 (фаза гипероксии) развитие сосудов сетчатки останавливается или замедляется при окклюзии и регрессии кровеносных сосудов в результате снижения VEGF и апоптоза эндотелиальных клеток ^24,30; в фазе 2 (фаза гипоксии) снабжение сетчатки кислородом станет недостаточным в условиях воздуха в помещении²⁹, что необходимо для развития нервной системы и гомеостаза ^19,31. Эта ишемическая ситуация обычно приводит к нерегулируемой, аномальной неоваскуляризации.

В настоящее время широко используемым методом моделирования является чередование высокого / низкого воздействия кислорода: матери и их детеныши подвергаются воздействию 75% кислорода в течение 5 дней при P7, а затем 5 дней в комнатном воздухе, пока P17 не продемонстрирует сопоставимые результаты²², что является конечной точкой индукции мышиной модели OIR. (Рисунок 1). В дополнение к моделированию РН, эта опосредованная ишемией патологическая неоваскуляризация также может быть использована для изучения других ишемических заболеваний сетчатки. Основные измерения этой модели включают количественную оценку площади VO и NV, которые анализируются из плоских креплений сетчатки путем иммунофлуоресцентного окрашивания или перфузии FITC-декстрана. Каждую мышь можно изучить только один раз из-за смертельной операции. В настоящее время существует мало методов наблюдения динамических изменений сосудистой системы сетчатки непрерывно в процессе сосудистой регрессии и патологического ангиогенеза³². В этой статье мы предоставляем подробный протокол индукции модели OIR, анализ плоских креплений сетчатки, а также рабочий процесс флуоресцеиновой ангиографии глазного дна (FFA) на мышах, что было бы полезно для получения более полного понимания сосудистых динамических изменений в течение двух фаз мышиной модели OIR.

Protocol

Все процедуры, связанные с использованием мышей, были одобрены комитетом по экспериментальной этике животных Офтальмологического центра Чжуншань Университета Сунь Ятсена, Китай (авторизованный номер: 2020-082), и в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по уходу и…

Representative Results

В мышиной модели OIR наиболее важным и базовым результатом является количественная оценка области VO и NV. После проживания в среде гипероксии в течение 5 дней от Р7 центральная сетчатка детенышей показала наибольшую неперфузионную площадь. При стимуляции гипоксии еще через 5 дней постепе?…

Discussion

На восприимчивость мышей к ОИР влияют многие факторы. Детенышей разного генетического происхождения и штаммов сравнивать нельзя. У мышей-альбиносов BALB/c сосуды быстро возвращаются в область VO со значительным снижением неоваскулярных пучков³⁸, что создает некоторые трудно?…

Materials

1 mL sterile syringe	Solarbio	YA0550	For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01	For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube	Corning	MCT-200-C	For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3548	For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides	Various		For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		For image analysis
Carbon dioxide gas	Various		For sacrifice
Cover slide	Various		For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps	World Precision Instruments	14127	For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution	Abcam	ab228549	For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope	Olmpus	SZ61	For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium	Sigma-Aldrich	F6377	For in vivo imaging
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2	For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01	For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose	Maya	89161	For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody	Invitrogen	I21413	For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J	GemPharmatech of Jiangsu Province		For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242	For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6	For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum	Abcam	ab7475	For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor	Various		For monitoring the level of O2
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148-1KG	For tissue fixation
Pentobarbital sodium	Various		For anesthesia
Soda lime	Various		For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0	IBM		For statistical analysis
Tansference decloring shaker	Kylin-Bell	ZD-2008	For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment)	Corning	3261-20EA	For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes	Various		For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818	For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide	Various		For in vivo imaging
ZEN Imaging Software	ZEISS		For image acquisition and export