Este artigo introduz o método de desenvolver, caracterizar e rastrear em tempo real a metástase tumoral no modelo de zebrafish de neuroblastoma, especificamente na linha de zebrafish transgênico com superexpressão de MYCN e LMO1, que desenvolve metástase espontaneamente.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
O zebrafish emergiu como um importante modelo animal para estudar doenças humanas, especialmente o câncer. Juntamente com as robustas tecnologias transgênicas e de edição de genomas aplicadas na modelagem de zebrafish, a facilidade de manutenção, produtividade de alto rendimento e poderosa imagem ao vivo fazem do zebrafish um valioso sistema modelo para estudar metástase e bases celulares e moleculares subjacentes a esse processo in vivo. O primeiro modelo de metástase do neuroblastoma de zebrafish (NB) foi desenvolvido superexpressando dois oncogenes, MYCN e LMO1, sob controle do promotor de dopamina-beta-hidroxilase (dβh). O MYCN e o LMO1 co-superexpressos levaram à redução da latência e ao aumento da penetração da neuroblastomagênese, bem como à metástase distante acelerada das células tumorais. Este novo modelo reitera de forma confiável muitas características-chave da NB metastática humana, incluindo o envolvimento de alterações genéticas clinicamente relevantes e associadas à metástase; desenvolvimento natural e espontâneo da metástase in vivo; e locais conservados de metástases. Portanto, o modelo de zebrafish possui vantagens únicas para dissecar o complexo processo de metástase tumoral in vivo.
Introdução
O zebrafish tem sido amplamente utilizado e aplicado em diversas áreas de pesquisa, especialmente no câncer. Este modelo oferece muitas vantagens - como sua reprodução robusta, manutenção econômica e visualização versátil do crescimento tumoral e metástase- tudo isso faz do zebrafish uma ferramenta poderosa para estudar e investigar as bases celulares e moleculares de tumorigênese e metástase. Novas técnicas para mapeamento de genomas em larga escala, transgênese, superexpressão ou nocaute de genes, transplante de células e telas químicas aumentaram imensamente o poder do modelo de zebrafish1. Nos últimos anos, muitas linhas de zebrafish foram ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os métodos de pesquisa utilizando zebrafish e cuidados/manutenção animal foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Clínica Mayo.
1. Preparação e microinjeção de construções transgênicas para o desenvolvimento da linha de zebrafish transgênico LMO1 com superexpressão em PSNS
- Para desenvolver o clone de entrada LMO1-pDONR221 , amplie a região de codificação do LMO1 humano a partir de cDNA obtido a partir da linha celular humana usando PCR.
- Faça uma reação de 25 μL conforme detalhado aqui: 2,5 μL de 10x padrão Taq Reaction Buffer, 0,125 μL de Taq DN....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para determinar se o LMO1 sinergiza com MYCN para afetar a patogênese NB, construções transgênicas que impulsionam a expressão de LMO1 (dβh:LMO1 e dβh:mCherry) ou MYCN (dβh:EGFP-MYCN) nas células PSNS sob controle do promotor dβh foram injetadas em embriões de zebrafish13. Conforme ilustrado na Figura 1A, após o desenvolvimento de linhas transgênicas estáveis e a validação de seus genótipos, os pe.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O zebrafish tem sido comumente utilizado em pesquisas nas últimas décadas, especialmente em pesquisas sobre câncer, por razões óbvias, como sua facilidade de manutenção, reprodução robusta e claras vantagens para a imagem in vivo1,28. O modelo de zebrafish pode ser facilmente manipulado embrionáriamente devido à sua fertilização e desenvolvimento externo, o que complementa bem aos organismos modelos de mamíferos, como ratos e camundongos, para estudos ge.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa R01 CA240323 (S.Z.) do Instituto Nacional de Câncer; uma subvenção W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) do Departamento de Defesa dos Estados Unidos (DoD); um prêmio V Scholar da V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e uma Bolsa de Plataforma do Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e suportes do Mayo Clinic Cancer Center e Centro de Medicina Individualizada (S.Z.).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| vetor | SK-4100 | do vetor do jogo do vetor da diaminobenzidina (DAB) | |
| Fisher científico/Acros orgânico | 64-19-7 | ||
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Pel-Freez | P40101 | ||
| Avidin/Biotina que obstrui o vetor | SP-2001 do jogo de bloqueio da hidroxilase (TH) | ||
| Detecção intensa de BOND R | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND diluente de anticorpo primário | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| Instrumento BOND-MAX IHC | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | sistema de coloração IHC totalmente automatizado |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC centro de recursos (BRFC) | N/A | |
| Microscópio composto equipado com câmera DP71 | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (meio de montagem à base de xileno) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | pronto para uso (sem necessidade de preparação) |
| Etanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expandir Sistema de PCR de Modelo Longo | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II mistura enzimática | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II mistura enzimática | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Anticorpo secundário anti-Rb de cabra (Biotinilado) | Dako | E0432 | |
| Solução de hematoxilina, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Ácido clorídrico | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Peróxido de hidrogênio, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzima | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Sulfato de canamicina | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Carbonato de Lítio | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Micrótomo para seccionamento | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Quimicamente Competente E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. de Utah | N/A | um presente generoso (Consulte a página da web http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page para obter material, que é distribuído livremente conforme descrito.) |
| Cera de parafina | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin para parafina |
| Paraformaldeído | Alfa Aesar | A11313 | |
| vetor pDEST (vetor de destino modificado contendo locais de reconhecimento I-SceI) | Dr. C. Grabher, Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha | N / A | um presente generoso |
| pDONR 221 vetor doador de gateway | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R vetor doador | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. de Utah | N/A | um generoso presente |
| vermelho de fenol, 0,5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Kit de coloração vermelha Picrosirrius | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
| Proteinase K, recombinante, PCR Grau | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Descalcificador Rápido | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Azida de Sódio (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Microscópio de fluorescência estéreo | Leica | MZ10F | |
| Microscópio de fluorescência estereoscópica equipado com uma câmera digital de mira DS-U1 para imagem de imagem | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polimerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 Processador de Infiltração a Vácuo AI | Sakura | N/A | Modelo #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xileno | Thermo Fisher | Scientific X3P1GAL |
Referências
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694(2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
