Zebrafisch-Modell der Neuroblastom-Metastasierung
Summary
Diese Arbeit stellt die Methode der Entwicklung, Charakterisierung und Verfolgung in Echtzeit der Tumormetastasierung im Zebrafischmodell des Neuroblastoms vor, insbesondere in der transgenen Zebrafischlinie mit Überexpression von MYCN und LMO1, die spontan Metastasen entwickelt.
Abstract
Zebrafische haben sich zu einem wichtigen Tiermodell entwickelt, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs, zu untersuchen. Zusammen mit den robusten transgenen und Genom-Editing-Technologien, die bei der Zebrafischmodellierung eingesetzt werden, machen die einfache Wartung, die ertragreiche Produktivität und die leistungsstarke Live-Bildgebung den Zebrafisch insgesamt zu einem wertvollen Modellsystem, um Metastasen und zelluläre und molekulare Grundlagen, die diesem Prozess zugrunde liegen, in vivo zu untersuchen. Das erste Zebrafisch-Neuroblastom -Modell (NB) der Metastasierung wurde durch Überexpression von zwei Onkogenen, MYCN und LMO1, unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (dβh) -Promotors entwickelt. Co-überexprimiertes MYCN und LMO1 führten zur reduzierten Latenz und erhöhten Penetranz der Neuroblastomagenese sowie zu einer beschleunigten Fernmetastasierung von Tumorzellen. Dieses neue Modell wiederholt zuverlässig viele Schlüsselmerkmale der metastasierenden NB beim Menschen, einschließlich der Beteiligung klinisch relevanter und metastasenassoziierter genetischer Veränderungen; natürliche und spontane Entwicklung von Metastasen in vivo; und konservierte Metastasenstellen. Daher besitzt das Zebrafischmodell einzigartige Vorteile, um den komplexen Prozess der Tumormetastasierung in vivo zu analysieren.
Introduction
Zebrafisch wurde in verschiedenen Forschungsbereichen, insbesondere bei Krebs, weit verbreitet und angewendet. Dieses Modell bietet viele Vorteile – wie seine robuste Reproduktion, kostengünstige Wartung und vielseitige Visualisierung von Tumorwachstum und Metastasierung -, die Zebrafische zu einem leistungsstarken Werkzeug machen, um die zellulären und molekularen Grundlagen der Tumorgenese und Metastasierung zu untersuchen und zu untersuchen. Neue Techniken für groß angelegte Genomkartierung, Transgenese, Genüberexpression oder Knockout, Zelltransplantation und chemische Screens haben die Leistungsfähigkeit des Zebrafischmodells immens erhöht1. In den letzten Jahren wurden viele Zebrafischlinien entwickelt, um die Tumorgenese und Metastasierung einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten zu untersuchen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Leukämie, Melanom, Rhabdomyosarkom und hepatozelluläres Karzinom2,3,4,5. Darüber hinaus wurde das erste Zebrafischmodell des Neuroblastoms (NB) durch Überexpression von MYCN, einem Onkogen, im peripheren sympathischen Nervensystem (PSNS) unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase(dβh)-Promotors erzeugt. Mit diesem Modell wurde weiter gezeigt, dass aktiviertes ALK mit MYCN synergistisch wirken kann, um den Tumorbeginn zu beschleunigen und die Tumorpenetranz de vivo zu erhöhen6.
NB stammt aus der sympathoadrenalen Linie der Neuralleistenzellen und ist ein hochmetastasierender Krebs bei Kindern7. Es ist für 10% der pädiatrischen Krebstodesfälle verantwortlich8. Bei der Diagnose weit verbreitet metastasiert, kann NB klinisch als Tumore dargestellt werden, die hauptsächlich entlang der Kette der sympathischen Ganglien und des Nebennierenmarks von PSNS9,10 entstehen. Die MYCN-Amplifikation ist häufig mit schlechten Ergebnissen bei NB-Patienten assoziiert11,12. Darüber hinaus wurde LMO1 als kritisches NB-Suszeptibilitätsgen in Hochrisikofällen identifiziert13,14. Studien fanden heraus, dass die transgene Koexpression von MYCN und LMO1 im PSNS des Zebrafischmodells nicht nur ein früheres Auftreten von NB fördert, sondern auch eine weit verbreitete Metastasierung in den Geweben und Organen induziert, die Stellen ähneln, die häufig bei Patienten mit Hochrisiko-NB13 beobachtet werden. Vor kurzem wurde ein weiterer metastasierender Phänotyp von NB auch in einem neueren Zebrafischmodell von NB beobachtet, in dem sowohl MYCN als auch Lin28B, die für ein RNA-bindendes Protein kodieren, unter Kontrolle des dβh-Promotors überexprimiert werden16.
Der stabile transgene Ansatz bei Zebrafischen wird häufig verwendet, um zu untersuchen, ob die Überexpression eines Gens von Interesse zur normalen Entwicklung und Pathogenese der Krankheit beitragen könnte14,15. Diese Technik wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bedeutung mehrerer Gene und Wege für die NB-Tumorgenese zu demonstrieren6,16,17,18,19,20. In diesem Beitrag wird vorgestellt, wie die transgene Fischlinie, die sowohl MYCN als auch LMO1 im PSNS überexprimiert, geschaffen wurde und wie gezeigt wurde, dass die Zusammenarbeit dieser beiden Onkogene den Beginn der NB-Tumorgenese und -Metastasierung beschleunigt13. Erstens wurde die transgene Linie, die EGFP-MYCN unter Kontrolle des dβh-Promotors überexprimiert (als MYCN-Linie bezeichnet), durch Injektion des dβh-EGFP-MYCN-Konstrukts in einZellstadium von Wildtyp-AB-Embryonen entwickelt, wie zuvor beschrieben6,17. Eine separate transgene Linie, die LMO1 im PSNS überexprimiert (als LMO1-Linie bezeichnet), wurde entwickelt, indem zwei DNA-Konstrukte, dβh-LMO1 und dβh-mCherry, in WT-Embryonen im Einzellstadium koprojiziert wurden13. Es wurde bereits gezeigt, dass koinjizierte Doppel-DNA-Konstrukte in das Fischgenom kointegriert werden können; Daher werden LMO1 und mCherry in den PSNS-Zellen der transgenen Tiere koexprimiert. Sobald die injizierten F0-Embryonen die Geschlechtsreife erreicht hatten, wurden sie dann mit WT-Fischen ausgekreuzt, um positive Fische mit Transgenintegration zu identifizieren. Kurz gesagt, die F1-Nachkommen wurden zuerst durch Fluoreszenzmikroskopie auf mCherry-Expression in den PSNS-Zellen untersucht. Die Keimbahnintegration von LMO1 in mCherry-positiven Fischen wurde durch genomische PCR und Sequenzierung weiter bestätigt. Nach erfolgreicher Identifizierung jeder transgenen Linie wurden die Nachkommen heterozygoter MYCN– und LMO1-transgener Fische miteinander verpaart, um eine zusammengesetzte Fischschnur zu erzeugen, die sowohl MYCN als auch LMO1 (als MYCN bezeichnet; LMO1-Linie). Tumortragendes MYCN; LMO1-Fische wurden alle zwei Wochen mittels Fluoreszenzmikroskopie auf hinweise auf metastasierende Tumore in den Regionen überwacht, die vom primären Ort, der Interrenaldrüsenregion (IRG, Zebrafischäquivalent der menschlichen Nebenniere) entfernt sind13. Um die Metastasierung von Tumoren in MYCN zu bestätigen; LMO1 Fisch,histologische und immunhistochemische Analysen wurden angewendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisch wurde in den letzten Jahrzehnten häufig in der Forschung verwendet, insbesondere in der Krebsforschung, aus offensichtlichen Gründen, wie z.B. seiner Wartungsfreundlichkeit, robusten Reproduktion und klaren Vorteilen für die In-vivo-Bildgebung1,28. Das Zebrafischmodell kann aufgrund seiner äußeren Befruchtung und Entwicklung leicht embryonal manipuliert werden, was sich gut zu Säugetiermodellorganismen wie Ratten und Mäusen für groß a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss R01 CA240323 (S.Z.) des National Cancer Institute unterstützt; einen Zuschuss W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) vom Verteidigungsministerium der Vereinigten Staaten (DoD); einen V Scholar Award der V Foundation for Cancer Research (S.Z.) und einen Platform Grant des Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); und Unterstützt durch das Mayo Clinic Cancer Center und das Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
Referências
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