Dette dokumentet introduserer metoden for å utvikle, karakterisere og spore i sanntid tumormetastase i sebrafiskmodell av nevroblastom, spesielt i den transgene sebrafisklinjen med overekspresjon av MYCN og LMO1, som utvikler metastase spontant.
Sebrafisk har dukket opp som en viktig dyremodell for å studere menneskelige sykdommer, spesielt kreft. Sammen med de robuste transgene og genomredigeringsteknologiene som brukes i sebrafiskmodellering, gjør enkel vedlikehold, høy avkastning produktivitet og kraftig levende bildebehandling helt sebrafisken til et verdifullt modellsystem for å studere metastase og cellulære og molekylære baser som ligger til grunn for denne prosessen in vivo. Den første sebrafisk neuroblastom (NB) modellen av metastase ble utviklet ved å overekspressere to oncogenes, MYCN og LMO1, under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (dβh) promotoren. Co-overekspressert MYCN og LMO1 førte til redusert latens og økt penetrans av nevroblastomagenese, samt akselerert fjern metastase av tumorceller. Denne nye modellen gjentar pålitelig mange viktige trekk ved human metastatisk NB, inkludert involvering av klinisk relevante og metastaseringsrelaterte genetiske endringer; naturlig og spontan utvikling av metastase in vivo; og bevarte områder av metastaser. Derfor har sebrafiskmodellen unike fordeler for å dissekere den komplekse prosessen med tumormetastase in vivo.
Sebrafisk har blitt mye brukt og anvendt på flere forskningsområder, spesielt i kreft. Denne modellen gir mange fordeler – for eksempel robust reproduksjon, kostnadseffektivt vedlikehold og allsidig visualisering av tumorvekst og metastase – som alle gjør sebrafisk til et kraftig verktøy for å studere og undersøke cellulære og molekylære baser av tumorigenesis og metastase. Nye teknikker for storskala genomkartlegging, transgenese, genovertrykk eller knockout, celletransplantasjon og kjemiske skjermer har enormt forsterket kraften i sebrafiskmodellen1. I løpet av de siste årene har mange sebrafisklinjer blitt utviklet for å studere tumorigenesis og metastase av en rekke menneskelige kreftformer, inkludert, men ikke begrenset til leukemi, melanom, rabdomyosarcoma og hepatocellulært karsinom2,3,4,5. I tillegg ble den første sebrafiskmodellen av nevroblastom (NB) generert ved å overekspressere MYCN, en oncogene, i det perifere sympatiske nervesystemet (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (dβh) promotoren. Med denne modellen ble det videre demonstrert at aktivert ALK kan synergisere med MYCN for å akselerere tumor utbruddet og øke tumorgjennomtrengende de vivo6.
NB er avledet fra den sympodrenale avstamningen av nevrale kamceller, og er en svært metastatisk kreft hos barn7. Det er ansvarlig for 10% av barnekreftrelaterte dødsfall8. Nb er bredt metastasert ved diagnose, og kan presenteres klinisk som svulster som hovedsakelig stammer fra kjeden av det sympatiske gangliaet og binyremedullaen til PSNS9,10. MYCN-forsterkning er ofte forbundet med dårlige utfall hos NB-pasienter11,12. Videre er LMO1 identifisert som et kritisk NB-følsomhetsgen i høyrisikotilfeller13,14. Studier fant at den transgene coexpression av MYCN og LMO1 i PSNS av sebrafiskmodellen ikke bare fremmer tidligere utbrudd av NB, men også induserer utbredt metastase til vev og organer som ligner steder som vanligvis ses hos pasienter med høyrisiko NB13. Svært nylig har en annen metastatisk fenotype av NB også blitt observert i en nyere sebrafiskmodell av NB, der både MYCN og Lin28B, som koder et RNA-bindende protein, er overekspressert under kontroll av dβh-promotoren16.
Den stabile transgene tilnærmingen i sebrafisk brukes ofte til å studere om overekspressering av et gen av interesse kan bidra til normal utvikling og sykdomspatogenese14,15. Denne teknikken har blitt brukt til å demonstrere betydningen av flere gener og veier til NB tumorigenesis6,16,17,18,19,20. Dette dokumentet vil introdusere hvordan den transgene fiskelinjen som overekspresserer både MYCN og LMO1 i PSNS ble opprettet og hvordan det ble demonstrert at samarbeidet mellom disse to oncogenes akselerere utbruddet av NB tumorigenesis og metastase13. For det første ble den transgene linjen som overekspresserer EGFP-MYCN under kontroll av dβh-promotoren (utpekt MYCN-linje) utviklet ved å injisere dβh-EGFP-MYCN-konstruksjonen i encellet stadium av wild-type (WT) AB embryoer, som tidligere beskrevet6,17. En egen transgen linje som overekspresserer LMO1 i PSNS (utpekt LMO1-linje) ble utviklet ved å mynte to DNA-konstruksjoner, dβh-LMO1 og dβh-mCherry, til WT-embryoer på encellet stadium13. Det har tidligere blitt demonstrert at myntede doble DNA-konstruksjoner kan myntes inn i fiskegenomet; Derfor er LMO1 og mCherry coexpressed i PSNS-cellene til de transgene dyrene. Når de injiserte F0-embryoene nådde seksuell modenhet, ble de deretter krysset med WT-fisk for identifisering av positiv fisk med transgene (er) integrasjon. Kort sagt ble F1-avkom først screenet av fluorescerende mikroskopi for mCherry-uttrykk i PSNS-cellene. Bakterieintegrasjonen av LMO1 i mCherry-positiv fisk ble ytterligere bekreftet av genomisk PCR og sekvensering. Etter vellykket identifisering av hver transgeniske linje ble avkommet av heterozygot MYCN og LMO1 transgen fisk interbred for å generere en sammensatt fiskelinje som uttrykker både MYCN og LMO1 (utpekt MYCN; LMO1-linje). Tumorbærende MYCN; LMO1 fisk ble overvåket av fluorescerende mikroskopi to uker for bevis på metastatiske svulster i regionene fjernt til det primære stedet, interrenal kjertel region (IRG, sebrafisk tilsvarende menneskelig binyrene)13. For å bekrefte metastase av svulster i MYCN; LMO1 fisk, histologiske og immunhiistokjemiske analyser ble brukt.
Sebrafisk har blitt ofte brukt i forskning de siste tiårene, spesielt i kreftforskning, av åpenbare grunner, for eksempel enkel vedlikehold, robust reproduksjon og klare fordeler for in vivo-avbildning1,28. Sebrafiskmodellen kan lett manipuleres embryonalt på grunn av deres eksterne befruktning og utvikling, som utfyller godt til pattedyrmodellorganismer, som rotter og mus, for store genetiske studier1,2,3<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd R01 CA240323 (S.Z.) fra National Cancer Institute; et tilskudd W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) fra USAs forsvarsdepartement (DoD); en V Scholar-pris fra V Foundation for Cancer Research (S.Z.) og et plattformstipend fra Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); og støtter fra Mayo Clinic Cancer Center og Center for Individualized Medicine (S.Z.).
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |