Disse protokoller indeholder den metode, der anvendes til at vurdere den enzymatiske aktivitet hos individuelle medlemmer af proteinalgininmethylentransferasefamilien (PRMT) i celler. Der er beskrevet detaljerede retningslinjer for vurdering af PRMT-aktivitet ved hjælp af endogene og eksogene biomarkører, methylalginin, der genkender antistoffer, og hæmmerværktøjsforbindelser.
Proteinmethyletransferaser (PRMT’er) katalyserer overførslen af en methylgruppe til argininrester af substratproteiner. PRMT-familien består af ni medlemmer, der kan monomethylat eller symmetrisk/asymmetrisk dimethylat argininrester. Flere antistoffer, der genkender forskellige typer argininmethylering af forskellige proteiner, er tilgængelige; således giver værktøjer til udvikling af PRMT aktivitet biomarkør assays. PRMT antistof-baserede assays er udfordrende på grund af overlappende substrater og motiv-baserede antistof specificiteter. Disse spørgsmål og den eksperimentelle opsætning til at undersøge argininmethylen, som de enkelte PRMT’er bidrager med, diskuteres. Gennem omhyggelig udvælgelse af de repræsentative substrater, der er biomarkører for otte ud af ni PRMT’er, blev der designet et panel af PRMT-aktivitetsanalyser. Her rapporteres protokollerne for cellulære analyser, der kvantitativt måler den enzymatiske aktivitet hos individuelle medlemmer af PRMT-familien i celler. Fordelen ved de beskrevne metoder er deres enkle ydeevne i ethvert laboratorium med cellekultur og fluorescerende vestlige blot kapaciteter. Substratspecifikiteten og den valgte antistofpålidelighed blev fuldt valideret med knockdown- og overekspressionsmetoder. Ud over detaljerede retningslinjer for assaybiomarkører og antistoffer gives der også oplysninger om brugen af en hæmmerværktøjsforbindelse til PRMT’er.
Argininmethylering er en vigtig postoversættelsesændring, der regulerer proteinprotein- og protein-RNA-interaktioner og dermed spiller en vigtig rolle i forskellige cellulære processer som præ-mRNA-splejsning, DNA-skade, transskriptionsrespons og vækstfaktormedieret transduktion1,2. Arginin er methyleret med protein arginin methyltransferaser (PRMTs), hvilket resulterer i monomethyl arginin (Rme1), asymmetrisk dimethylarginin (Rme2a), eller symmetrisk dimethylarginin (Rme2s)3. Baseret på methyleringstypen klassificeres PRMT’er i tre grupper: Type I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 og 8), som katalyserer mono- og asymmetrisk dimethylering; Type II (PRMT5 og PRMT9), som katalyserer mono- og symmetrisk dimethylering; og type III (PRMT7), som kun kan monomethylat arginin3.
På grund af et stigende antal kommercielt tilgængelige argininmethyle methyleringsspecifikke antistoffer kan PRMT-aktivitet måles ved hjælp af vestlig blotting. Fluorescerende-baserede vestlige blot er den foretrukne teknik over chemiluminescent afsløring på grund af en større dynamikområde og linearitet, højere følsomhed, og giver mulighed for multiplexing4. For at kvantificere proteinmethylenniveauerne kræves normalisering af methyleringssignalet til det samlede proteinniveau. Ved at vælge antistofferne for totalt og methyleret protein, der er opdrættet i forskellige værtsarter (f.eks. mus og kanin), kan der anvendes sekundære antistoffer mærket med forskellige fluorophorer, og signalet for begge antistoffer kan bestemmes i samme prøvebånd. Methyl-arginin antistoffer blev udviklet til at identificere og karakterisere monomethylerede, asymmetrisk eller symmetrisk dimethylerede proteiner, hvor methyl-arginin findes i en bestemt sammenhæng. Da størstedelen af PRMT’ernes methylatglycin- og argininrige motiver i deres substrater5, blev der opdrættet flere antistoffer for peptider, der indeholder monomethyl eller asymmetriske, symmetriske dimethyl-arginin-glycin-gentagelser som henholdsvis D5A12, ASYM24 eller ASYM25 og SYM11. Andre methylalgininantistoffer blev genereret mod et peptidbibliotek, der indeholder asymmetrisk, symmetrisk dimethyl- og monomethylalginin i en gentagen sammenhæng, der letter påvisning af methylalginin i disse særlige sammenhænge6. Der er også et stigende antal antistoffer, der genkender specifikke arginin mærke på et enkelt protein, som muliggør selektiv påvisning af methylering såsom histone H4R3me2a eller BAF155-R1064me2a.
Der er flere kommercielt tilgængelige PRMT-hæmmere, som kan bruges som værktøjer til PRMT cellulære assays. Men ikke alle af dem er grundigt karakteriseret for selektivitet og off-target effekter, og nogle bør bruges med forsigtighed. Det strukturelle genomiske konsortium har i samarbejde med akademiske laboratorier og pharmapartnere udviklet velkaraktererede potente, selektive og cellegennemtrængelige PRMT-hæmmere (kemiske sonder), der kan bruges uden begrænsninger af det videnskabelige samfund. Oplysninger om disse hæmmere kan findes på https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics og https://www.chemicalprobes.org/. Kemiske sonder er små molekylehæmmere med in vitro IC 50 eller Kd < 100 nM, over 30 gange selektivitet over proteiner i samme familie og betydelig cellulær aktivitet ved 1 μM. Derudover har hver kemisk sonde en tæt kemisk analog, der er inaktiv i forhold til det tilsigtede mål7,8,9,10,11,12.
Målet med denne protokol er at måle den cellulære aktivitet af individuelle PRMT familiemedlemmer ved hjælp af fluorescerende vestlige blot metode. Her gives detaljerede oplysninger om validerede assaybiomarkører, antistoffer og potente celleaktive hæmmere samt værdifulde strategier for vellykket analyseimplementering.
Her beskrives de detaljerede cellulære analyseprotokoller for medlemmer af PRMT-familien, der bruger fluorescerende vestlige blotting-metoder. Unikke substrater, for hvilke ændringerne i argininmethylen let kan påvises ved individuel PRMT-tab eller katalytisk hæmning og ikke kan kompenseres af andre familiemedlemmer, blev valgt. Nogle proteiner er methyleret af flere PRMT’er21,23, hvilket tyder på en overlapning i substrat specificitet, hvor nogle PRMT’er kun bidrager med en lille mængde cellulært mærke i et givet proteinsubstrat24,25,26,27, for eksempel bidrager både PRMT8 og PRMT1 til methylering af EWS. Derfor krævede hver analyse grundig validering af substrater og antistoffer med knockdown og / eller overekspressionseksperimenter og yderligere validering med velkaraktererede selektive hæmmere. Der blev identificeret PRMT-specifikke substrater, for hvilke der kunne påvises ændringer i methyleringsmærket inden for 2-3 dage efter PRMT-tab/hæmning for at undgå sammensatte virkninger af nedsat celles levedygtighed og spredning, som indirekte kan påvirke methylalgininmærkeniveauerne. Selv om det var muligt at finde unikke substrater til PRMT1, 4, 5, 7 og 9; for PRMT3, 6 og 8 skulle funktionstilgangen anvendes. Flere argininmethylespecifikke antistoffer blev testet for forskellige cellulære mål, men ingen var i stand til at påvise væsentlige ændringer inden for 3 dage efter PRMT3 og PRMT6 knockdown; Derfor blev biomarkøranalyser udviklet ved hjælp af ektopisk udtrykte enzymer sammen med katalytisk inaktive mutanter, der fungerede som kontrol for basissubstratmethyleneringen. PRMT8 er en tæt PRMT1 homolog og deler lignende substratpræferencer. Da en PRMT8 selektiv biomarkør ikke kunne identificeres, blev der udviklet en analyse i PRMT1 knockdown-celler, hvor PRMT8 blev udtrykt sammen med EWS. PRMT1 er også et stort enzym, der er ansvarlig for H4R3 asymmetrisk methylering, derfor at bruge H4R3me2a som biomarkør for PRMT3 og PRMT6 cellulære assays, celler med lave basale H4R3me2a niveauer blev valgt samt katalytisk inaktive mutanter blev brugt som baggrundskontrol. Selv om endogene assays foretrækkes, exogenous assays vise sig uvurderlig for at teste den cellulære styrke af flere selektive PRMT hæmmere7,8,9. Med voksende viden om PRMT biologi forventer vi at forbedre analysen ved at finde mere specifikke biomarkørproteiner til PRMT3, PRMT6 og PRMT8.
Brugen af validerede antistoffer og passende kontroller er afgørende for PRMT-analysens ydeevne. Alle antistoffer, der anbefales her, er blevet grundigt valideret af knockdown- og overekspressionseksperimenter, men batch-til-batch-forskelle, især i tilfælde af polyklonale antistoffer, kan stadig påvirke deres ydeevne. Derfor er det afgørende at bruge genetiske metoder og kemiske sonder sammen med deres nært beslægtede negative kontroller for at bekræfte analysens pålidelighed. For PRMT-analyse, der kræver proteinovertryk, er det desuden afgørende at bruge katalytisk inaktive mutanter sammen med protein af vild type til at bestemme de basale methyleringsniveauer.
Denne samling af kvantitative analyser til profilering af PRMT’s aktivitet i celler kan i det store og hele være nyttig for det videnskabelige samfund, da det hurtigt og nemt kan gennemføres med minimalt udstyr og begrænset teknisk ekspertise, der kun omfatter grundlæggende cellekultning og fluorescerende vestlige blotting-teknikker. De anbefalede antistoffer og kemiske sonder for PRMT’er kan også anvendes til aktivitetsbaserede proteinprofileringsanalyser (ABPP) for at fastslå egnetheden af en given ABPP-sonde, overvåge målengagement og vurdere off-target-effekter ved hjælp af det konkurrencedygtige ABPP-format. De analyseudviklingsmetoder, der diskuteres her, kan også ekstrapoleres for andre enzymfamilier såsom protein lysin-methyltransferaser og acetyletransferaser.
The authors have nothing to disclose.
Structural Genomics Consortium er en registreret velgørenhedsorganisation (nr. 1097737), der modtager midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gennem Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gennem Joint Undertaking 2 i initiativet for innovative lægemidler [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |