ये प्रोटोकॉल कोशिकाओं में प्रोटीन आर्जिनाइन मिथाइलट्रांसफेरेज (पीआरएमटी) परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों की एंजाइमेटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति प्रदान करते हैं। अंतर्जात और बहिर्जात बायोमार्कर का उपयोग करके पीआरएमटी गतिविधि का आकलन करने, एंटीबॉडी को पहचानने वाले मिथाइल-आर्जिनिन और अवरोधक उपकरण यौगिकों का वर्णन किया गया है।
प्रोटीन मिथाइलट्रांसफेरेस (पीआरएमटीएस) सब्सट्रेट प्रोटीन के आर्जिनिन अवशेषों के लिए एक मिथाइल समूह के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है। पीआरएमटी परिवार में नौ सदस्य होते हैं जो एकमेथिलेट या सममित/विषम रूप से डिमेथिलेट आर्जिनिन अवशेषों को एकामेथिलेट कर सकते हैं । विभिन्न प्रोटीन के विभिन्न प्रकार के आर्जिनिन मिथाइलेशन को पहचानने वाले कई एंटीबॉडी उपलब्ध हैं; इस प्रकार, पीआरएमटी गतिविधि बायोमार्कर परख के विकास के लिए उपकरण प्रदान करना। पीआरएमटी एंटीबॉडी-आधारित परख ओवरलैपिंग सब्सट्रेट्स और आकृति-आधारित एंटीबॉडी विशिष्टताओं के कारण चुनौतीपूर्ण हैं। इन मुद्दों और प्रयोगात्मक सेटअप अलग पीआरएमटी द्वारा योगदान arginine मिथाइलेशन की जांच करने के लिए चर्चा कर रहे हैं । प्रतिनिधि सब्सट्रेट्स के सावधानीपूर्वक चयन के माध्यम से जो नौ पीआरएमटी में से आठ के लिए बायोमार्कर हैं, पीआरएमटी गतिविधि परख का एक पैनल डिजाइन किया गया था। यहां, कोशिकाओं में पीआरएमटी परिवार के व्यक्तिगत सदस्यों की एंजाइमेटिक गतिविधि को मापने वाले सेलुलर परख के लिए प्रोटोकॉल की सूचना दी जाती है। वर्णित तरीकों का लाभ सेल संस्कृति और फ्लोरोसेंट पश्चिमी दाग क्षमताओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला में उनका सीधा प्रदर्शन है। सब्सट्रेट विशिष्टता और चुनी गई एंटीबॉडी विश्वसनीयता को नॉकडाउन और अतिव्यक्तता दृष्टिकोणों के साथ पूरी तरह से मान्य किया गया था। परख बायोमार्कर और एंटीबॉडी के विस्तृत दिशानिर्देशों के अलावा, पीआरएमटीएस के लिए अवरोधक उपकरण यौगिक संग्रह के उपयोग के बारे में जानकारी भी प्रदान की गई है।
आर्जिनिन मिथाइलेशन एक महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है जो प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन को नियंत्रित करता है, इस प्रकार विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग, डीएनए क्षति, ट्रांसक्रिप्शन रिस्पांस, और विकास कारक-मध्यस्थता ट्रांसडक्शन1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आर्जिनिन को प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेस (पीआरएमटीएस) द्वारा मेथिलेटेड किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप मोनोमिथाइल आर्जिनिन (आरएमई 1), विषम डाइमेथाइलरजिनिन (आरएमई2ए), या सममित डिमेथाइलरिन (आरम2एस)3। मिथाइलेशन प्रकार के आधार पर, पीआरएमटी को तीन समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: टाइप I (PRMT1, 2, 3, 4, 6, और 8), जो मोनो-और असममित डाइमेथाइलेशन को उत्प्रेरित करता है; टाइप II (पीआरएमटी5 और पीआरएमटी9), जो मोनो और सममित डाइमिथाइलेशन को उत्प्रेरित करता है; और टाइप III (PRMT7), जो केवल मोनोमेथिलेट आर्जिनिन3कर सकते हैं।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आर्जिनिन मिथाइलेशन-विशिष्ट एंटीबॉडी की बढ़ती संख्या के कारण, पीआरएमटी गतिविधि को पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके मापा जा सकता है। फ्लोरोसेंट आधारित पश्चिमी दाग एक अधिक गतिशील रेंज और रैखिकता, उच्च संवेदनशीलता, और मल्टीप्लेक्सिंग4के लिए अनुमति देने के कारण केमिल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन पर पसंदीदा तकनीक है। प्रोटीन मिथाइलेशन के स्तर को निर्धारित करने के लिए, कुल प्रोटीन स्तर के लिए मिथाइलेशन सिग्नल को सामान्य बनाने की आवश्यकता होती है। विभिन्न मेजबान प्रजातियों (जैसे, माउस और खरगोश) में उठाए गए कुल और मिथाइलेटेड प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का चयन करके, विभिन्न फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है और दोनों एंटीबॉडी के लिए संकेत एक ही नमूना बैंड में निर्धारित किया जा सकता है। मिथाइल-आर्जिनिन एंटीबॉडी को मोनोमेथिलेटेड, विषम रूप से, या सममित रूप से डिमेथाइलेटेड प्रोटीन की पहचान करने और चित्रित करने के लिए विकसित किया गया था जहां मिथाइल-आर्जिनिन एक विशिष्ट संदर्भ में पाया जाता है। चूंकि उनके सब्सट्रेट्स5के भीतर अधिकांश पीआरएमटी मेथिलेट ग्लाइसिन-और आर्जिनिन-रिच रूपांकनों के बाद, क्रमशः एकामिथाइल या असममित, सममित डिमेथिल-आर्जिनिन-ग्लाइसिन दोहराने वाले पेप्टाइड्स के लिए कई एंटीबॉडी उठाए गए थे। अन्य मिथाइल-आर्जिनिन एंटीबॉडी एक पेप्टाइड पुस्तकालय के खिलाफ उत्पन्न हुए थे जिसमें सममित, सममित डाइमिथाइल और मोनोमिथाइल आर्जिनिन एक दोहराने के संदर्भ में थे जिससे इन विशेष संदर्भों में मिथाइल-आर्जिनिन का पता लगाने में मदद मिली6। एंटीबॉडी की बढ़ती संख्या भी है जो एक प्रोटीन पर विशिष्ट आर्जिनिन मार्क को पहचानती है जो मिथाइलेशन जैसे हिस्टोन एच4आर3एमईए या BAF155-R1064me2a का चयनात्मक पता लगाने में सक्षम है।
कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीआरएमटी अवरोधक हैं, जिन्हें पीआरएमटी सेलुलर परख के लिए उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, उन सभी को चयनशीलता और ऑफ-टारगेट प्रभावों के लिए अच्छी तरह से विशेषता नहीं है और कुछ का उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। संरचनात्मक जीनोमिक कंसोर्टियम, अकादमिक प्रयोगशालाओं और फार्मा भागीदारों के सहयोग से, अच्छी तरह से विशेषता शक्तिशाली, चयनात्मक, और सेल पारगम्य पीआरएमटी अवरोधकों (रासायनिक जांच) है कि वैज्ञानिक समुदाय द्वारा कोई प्रतिबंध के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित किया है । इन अवरोधकों के बारे में जानकारी https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics और https://www.chemicalprobes.org/ पर पाया जा सकता है। रासायनिक जांच इन विट्रो आईसी50 या केडी < 100 एनएम के साथ छोटे अणु अवरोधक होते हैं, एक ही परिवार में प्रोटीन पर 30 गुना अधिक चयनता, और 1 माइक्रोन पर महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधि होती है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक रासायनिक जांच में एक करीबी रासायनिक एनालॉग होता है जो इच्छित लक्ष्य7,8,9,10,11, 12के खिलाफ निष्क्रिय है।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य फ्लोरोसेंट पश्चिमी दाग विधि का उपयोग करके व्यक्तिगत पीआरएमटी परिवार के सदस्यों की सेलुलर गतिविधि को मापना है। यहां मान्य परख बायोमार्कर, एंटीबॉडी, और शक्तिशाली सेल-सक्रिय अवरोधकों के साथ-साथ सफल परख कार्यान्वयन के लिए मूल्यवान रणनीतियों के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की जाती है।
यहां, पीआरएमटी परिवार के सदस्यों के लिए विस्तृत सेलुलर परख प्रोटोकॉल वर्णित हैं कि फ्लोरोसेंट पश्चिमी ब्लॉटिंग विधियों का उपयोग करें। अद्वितीय सब्सट्रेट्स जिसके लिए आर्जिनिन मिथाइलेशन में परिवर्तन को व्यक्तिगत पीआरएमटी हानि या उत्प्रेरक अवरोध पर आसानी से पता लगाया जा सकता है और परिवार के अन्य सदस्यों द्वारा मुआवजा नहीं दिया जा सकता है। कुछ प्रोटीन को मल्टीपल पीआरएमटी21, 23द्वारा मेथिलेटेड कियाजाताहै, जो सब्सट्रेट विशिष्टता में ओवरलैप का सुझाव देता है, जहां कुछ पीआरएमटी किसी दिए गए प्रोटीन सब्सट्रेट24,25, 26,27में केवल थोड़ी मात्रा में सेलुलर मार्क का योगदान करते हैं, उदाहरण के लिए, पीआरएमटी8 और पीआरएमटी1 दोनों ईडब्ल्यूएस के मिथाइलेशन में योगदान देते हैं। इसलिए, प्रत्येक परख में नॉकडाउन और/या अतिव्यक्तता प्रयोगों के साथ सब्सट्रेट्स और एंटीबॉडी की पूरी तरह से सत्यापन और अच्छी तरह से विशेषता वाले चयनात्मक अवरोधकों के साथ आगे सत्यापन की आवश्यकता होती है । पीआरएमटी विशिष्ट सब्सट्रेट्स की पहचान की गई थी जिसके लिए कम सेल व्यवहार्यता और प्रसार के जटिल प्रभावों से बचने के लिए 2-3 दिनों के भीतर मिथाइलेशन मार्क परिवर्तनों का पता लगाया जा सकता है जो अप्रत्यक्ष रूप से मिथाइल-आर्जिनिन मार्क स्तर को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि पीआरएमटी 1, 4, 5, 7 और 9 के लिए अद्वितीय सब्सट्रेट्स ढूंढना संभव था; PRMT3, 6, और 8 के लिए समारोह दृष्टिकोण का लाभ नियोजित किया जाना था । विभिन्न सेलुलर लक्ष्यों के लिए कई आर्जिनिन मिथाइल-विशिष्ट एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया था, लेकिन कोई भी PRMT3 और PRMT6 नॉकडाउन के 3 दिनों के भीतर महत्वपूर्ण परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम नहीं था; इसलिए, बायोमार्कर परख को उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय म्यूटेंट के साथ एक साथ एक्टोपिकल रूप से व्यक्त एंजाइमों का उपयोग करके विकसित किया गया था, जो बेसलाइन सब्सट्रेट मिथाइलेशन के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता था। PRMT8 एक करीबी PRMT1 समरूप है और इसी तरह की सब्सट्रेट वरीयताओं को साझा करता है। एक PRMT8 चयनात्मक बायोमार्कर की पहचान नहीं की जा सकती है, पीआरएमटी 1 नॉकडाउन कोशिकाओं में एक परख विकसित की गई थी, जहां PRMT8 को ईडब्ल्यूएस के साथ सह-व्यक्त किया गया था। PRMT1 एच4आर 3 असममित मिथाइलेशन के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख एंजाइम भी है, इसलिए, PRMT3 और PRMT6 सेलुलर परख के लिए एक बायोमार्कर के रूप में H4R3me2a का उपयोग करने के लिए, कम बेसल H4R3me2a स्तर वाली कोशिकाओं को चुना गया था और साथ ही उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय म्यूटेंट का उपयोग पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में किया गया था। यद्यपि अंतर्जात परख को प्राथमिकता दी जाती है, लेकिन कई चुनिंदा पीआरएमटी अवरोधकों7,8,9की सेलुलर शक्ति का परीक्षण करने के लिए बहिर्जात परख अमूल्य साबित होती है। पीआरएमटी जीव विज्ञान के बढ़ते ज्ञान के साथ, हम PRMT3, PRMT6, और PRMT8 के लिए अधिक विशिष्ट बायोमार्कर प्रोटीन खोजने के द्वारा परख में सुधार की उम्मीद करते हैं।
पीआरएमटी परख प्रदर्शन के लिए मान्य एंटीबॉडी और उचित नियंत्रण का उपयोग महत्वपूर्ण है। यहां अनुशंसित सभी एंटीबॉडी को नॉकडाउन और अतिव्यक्तता प्रयोगों द्वारा अच्छी तरह से मान्य किया गया है, हालांकि, बैच-टू-बैच अंतर, विशेष रूप से पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के मामले में, अभी भी उनके प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, परख विश्वसनीयता की पुष्टि करने के लिए आनुवंशिक तरीकों और रासायनिक जांच का उपयोग उनके बारीकी से संबंधित नकारात्मक नियंत्रणों के साथ करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, पीआरएमटी परख के लिए, जिसमें प्रोटीन ओवरएक्सप्रेशन की आवश्यकता होती है, बेसल मिथाइलेशन स्तर निर्धारित करने के लिए जंगली प्रकार के प्रोटीन के साथ उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय म्यूटेंट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
कोशिकाओं में पीआरएमटी की गतिविधि की प्रोफाइलिंग के लिए मात्रात्मक परख का यह संग्रह वैज्ञानिक समुदाय के लिए मोटे तौर पर उपयोगी हो सकता है क्योंकि इसे न्यूनतम उपकरणों और सीमित तकनीकी विशेषज्ञता के साथ तेजी से और आसानी से लागू किया जा सकता है, जिसमें केवल बुनियादी सेल culturing और फ्लोरोसेंट पश्चिमी ब्लॉटिंग तकनीक शामिल हैं। पीआरएमटीएस के लिए अनुशंसित एंटीबॉडी और रासायनिक जांच का उपयोग गतिविधि-आधारित प्रोटीन प्रोफाइलिंग (एबीपीपी) के लिए भी किया जा सकता है ताकि किसी दिए गए एबीपीपी जांच की उपयुक्तता स्थापित की जा सके, लक्ष्य सगाई की निगरानी की जा सके और प्रतिस्पर्धी ABPP प्रारूप का उपयोग करके ऑफ-टारगेट प्रभावों का आकलन किया जा सके । यहां चर्चा किए गए परख विकास दृष्टिकोणों को प्रोटीन lysine-मिथाइलट्रांसफेरेस और एसिटाइलट्रांसफेरेस जैसे अन्य एंजाइम परिवारों के लिए भी एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कंसोर्टियम एक पंजीकृत चैरिटी है (नहीं: 1097737) जो AbbVie, बायर एजी से धन प्राप्त करता है, बोहरिंगर इंगलहेम, जेनेटेक, जीनोम कनाडा के माध्यम से ओंटारियो जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट [ओजीआई-196], इनोवेटिव मेडिसिन्स इनिशिएटिव 2 ज्वाइंट अंडरटेकिंग [ईउबोपेन ग्रांट 875510], जानसेन, मर्क केगाए (कनाडा और अमेरिका में उर्फ ईएमडी), फाइजर, लेडा और वेलकम ट्रस्ट [106169/14/Z]।
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |