Dessa protokoll ger den metod som används för att bedöma enzymatisk aktivitet hos enskilda medlemmar av proteinet argininmetyltransferas (PRMT) i celler. Detaljerade riktlinjer för bedömning av PRMT verksamhet med hjälp av endogena och exogena biomarkörer, metyl-arginin erkänna antikroppar och inhibitor verktyg föreningar beskrivs.
Proteinmetyltransferaser (PRMTs) katalyserar överföringen av en metylgrupp till argininrester av substratproteiner. PRMT-familjen består av nio medlemmar som kan monomethylate eller symmetrically/asymmetrically dimetylate arginin rester. Flera antikroppar som känner igen olika typer av arginin metylering av olika proteiner finns tillgängliga; tillhandahålla verktyg för utveckling av BIOMARKÖR-analyser för PRMT-aktivitet. PRMT-antikroppsbaserade analyser är utmanande på grund av överlappande substrat och motivbaserade antikroppsspecifikationer. Dessa frågor och den experimentella inställningen för att undersöka arginin metylering bidragit av enskilda PRMTs diskuteras. Genom noggrant urval av de representativa substrat som är biomarkörer för åtta av nio PRMTs utformades en panel av PRMT-aktivitetsanalyser. Här rapporteras protokollen för cellulära analyser kvantitativt mäta enzymatiska verksamhet av enskilda medlemmar av PRMT familjen i celler. Fördelen med de beskrivna metoderna är deras enkla prestanda i alla labb med cellkultur och fluorescerande västerländska fläckar. Substrat specificitet och valda antikroppar tillförlitlighet var helt validerade med knockdown och överuttryck metoder. Förutom detaljerade riktlinjer för analysbiomarkörer och antikroppar tillhandahålls också information om användningen av en insamling av inhibitorverktygsföreningar för PRMTs.
Arginin metylering är en viktig post-translationell modifiering som reglerar protein-protein och protein-RNA interaktioner, vilket spelar en viktig roll i olika cellulära processer såsom pre-mRNA splitsning, DNA-skador, transkription svar och tillväxtfaktormedierad transduktion1,2. Arginin är metylerat med protein argininmetyltransferaser (PRMTs) vilket resulterar i monometyl arginin (Rme1), asymmetriskt dimetyllarginin (Rme2a) eller symmetriskt dimetyllarginin (Rme2s)3. Baserat på metyleringstypen klassificeras PRMTs i tre grupper: typ I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 och 8), som katalyserar mono- och asymmetrisk dimetylering; Typ II (PRMT5 och PRMT9), som katalyserar mono- och symmetrisk dimetylering. och typ III (PRMT7), som endast kan monomeetylat arginin3.
På grund av ett växande antal kommersiellt tillgängliga arginin metyleringsspecifika antikroppar, PRMT verksamhet kan mätas med hjälp av västra blotting. Fluorescerande-baserade västra fläck är den föredragna tekniken framför chemiluminescent detektion på grund av ett större dynamiskt omfång och linjäritet, högre känslighet och möjliggör multiplexering4. För att kvantifiera proteinmetyleringsnivåerna krävs normalisering av metyleringssignalen till totala proteinnivåer. Genom att välja antikroppar för totalt och metylerat protein som odlas i olika värdarter (t.ex. mus och kanin) kan sekundära antikroppar märkta med olika fluorforer användas och signalen för båda antikropparna kan bestämmas i samma provband. Metyl-arginin antikroppar utvecklades för att identifiera och karakterisera monomethylerade, asymmetriskt eller symmetriskt dimetylerade proteiner där metyl-arginin finns i ett specifikt sammanhang. Eftersom majoriteten av PRMTs metylat glycin- och argininrika motiv inom sina substrat5, flera antikroppar höjdes för peptiderna som innehåller monometyl eller asymmetriska, symmetriska dimetyl-arginin-glycinrepetitioner såsom D5A12, ASYM24 eller ASYM25 respektive SYM11. Andra metyl-arginin antikroppar genererades mot ett peptid bibliotek som innehåller asymmetrisk, symmetrisk dimetyl- och monomethyl arginin i ett upprepat sammanhang som underlättar upptäckten av metyl-arginin i dessa särskilda sammanhang6. Det finns också ett ökande antal antikroppar som känner igen specifikt argininmärke på ett enda protein som möjliggör selektiv detektion av metylering såsom histon H4R3me2a eller BAF155-R1064me2a.
Det finns flera kommersiellt tillgängliga PRMT-hämmare, som kan användas som verktyg för PRMT-cellulära analyser. Men inte alla av dem kännetecknas grundligt för selektivitet och off-target effekter och vissa bör användas med försiktighet. Structural Genomic Consortium har i samarbete med akademiska laboratorier och läkemedelspartners utvecklat väl karakteriserade potenta, selektiva och cellgenomsläppliga PRMT-hämmare (kemiska sonder) som kan användas utan begränsningar av forskarsamhället. Information om dessa hämmare finns på https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics och https://www.chemicalprobes.org/. Kemiska sonder är småmolekylhämmare med in vitro IC 50 eller Kd < 100 nM, över 30-faldig selektivitet över proteiner i samma familj och betydande cellulär aktivitet vid 1 μM. Dessutom har varje kemisk sond en nära kemisk analog som är inaktiv mot det avsedda målet7,8,9,10,11,12.
Målet med detta protokoll är att mäta cellulär aktivitet hos enskilda PRMT-familjemedlemmar med hjälp av fluorescerande western blot-metoden. Här ges detaljerad information om validerade analysbiomarkörer, antikroppar och potenta cellaktiva hämmare samt värdefulla strategier för framgångsrik analysimplementering.
Här beskrivs de detaljerade cellulära analysprotokollen för medlemmar av PRMT-familjen som använder fluorescerande västerländska blottningsmetoder. Unika substrat för vilka förändringarna i arginin metylering lätt kan detekteras vid individuell PRMT förlust eller katalytisk hämning och kan inte kompenseras av andra familjemedlemmar valdes. Vissa proteiner är metylerade av flera PRMTs21,23, vilket tyder på en överlappning i substrat specificitet där vissa PRMTs bidrar endast en liten mängd cellulära märke i ett givet protein substrat24,25,26,27, till exempel bidrar både PRMT8 och PRMT1 till metylering av EWS. Därför krävde varje analys noggrann validering av substrat och antikroppar med knockdown och/eller överuttrycksexperiment och ytterligare validering med väl karakteriserade selektiva hämmare. PRMT-specifika substrat identifierades för vilka metyleringsmärke förändringar kunde detekteras inom 2-3 dagar efter PRMT förlust/hämning för att undvika sammansatta effekter av minskad cell livskraft och spridning som indirekt kan påverka metyl-arginin mark nivåer. Även om det var möjligt att hitta unika substrat för PRMT1, 4, 5, 7 och 9; För PRMT3, 6 och 8 måste man använda sig av funktionssätt. Flera arginin metyl-specifika antikroppar testades för olika cellulära mål, men ingen kunde upptäcka betydande förändringar inom 3 dagar efter PRMT3 och PRMT6 knockdown; Därför utvecklades biomarköranalyser med hjälp av extopiskt uttryckta enzymer tillsammans med katalytiskt inaktiva mutanter, som fungerade som en kontroll för baslinjen substrat metylering. PRMT8 är en nära PRMT1 homolog och delar liknande substrat preferenser. Eftersom en PRMT8 selektiv biomarkör inte kunde identifieras, utvecklades en analys i PRMT1 knockdown celler, där PRMT8 uttrycktes tillsammans med EWS. PRMT1 är också ett stort enzym som ansvarar för H4R3 asymmetrisk metylering, därför, att använda H4R3me2a som biomarkör för PRMT3 och PRMT6 cellulära analyser, celler med låg basala H4R3me2a nivåer valdes samt katalytiskt inaktiva mutanter användes som bakgrundskontroll. Även om endogena analyser föredras, visar exogena analyser ovärderliga för att testa cellulär styrka hos flera selektiva PRMT-hämmare7,8,9. Med växande kunskap om PRMT-biologi förväntar vi oss att förbättra analyserna genom att hitta mer specifika biomarkörproteiner för PRMT3, PRMT6 och PRMT8.
Användningen av validerade antikroppar och lämpliga kontroller är avgörande för PRMT-analysprestandan. Alla antikroppar som rekommenderas här har validerats grundligt genom knockdown och överuttryck experiment, men batch-till-batch skillnader, särskilt när det gäller polyklonala antikroppar, kan fortfarande påverka deras prestanda. Därför är det viktigt att använda genetiska metoder och kemiska sonder tillsammans med deras nära besläktade negativa kontroller för att bekräfta analysens tillförlitlighet. För PRMT-analyser som kräver proteinöveruttryck är det dessutom viktigt att använda katalytiskt inaktiva mutanter tillsammans med vildprotein för att bestämma de basala metyleringsnivåerna.
Denna samling av kvantitativa analyser för profilering av PRMTs verksamhet i celler kan vara i stort sett användbar för forskarsamhället eftersom den snabbt och enkelt kan genomföras med minimal utrustning och begränsad teknisk expertis, som endast omfattar grundläggande cellodling och fluorescerande västerländska blotting-tekniker. De rekommenderade antikropparna och kemiska sonderna för PRMTs kan också användas för aktivitetsbaserade proteinprofileringsanalyser (ABPP) för att fastställa lämpligheten hos en viss ABPP-sond, övervaka målengagemang och bedöma effekter utanför målet med hjälp av det konkurrenskraftiga ABPP-formatet. De analysutvecklingsmetoder som diskuteras här kan också extrapoleras för andra enzymfamiljer som proteinlyin-metyltransferaser och acetyltransferaser.
The authors have nothing to disclose.
Structural Genomics Consortium är en registrerad välgörenhetsorganisation (nr: 1097737) som får medel från AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada genom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU och EFPIA genom det gemensamma företaget Innovative Medicines Initiative 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (även känd som EMD i Kanada och USA), Pfizer, Takeda och Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |