緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価ツール
Summary
合成嚢胞性線維化痰培地(SCFM2)は、共焦点レーザー走査顕微鏡と蛍光活性化細胞選別の両方と組み合わせて利用して、細菌凝集体を高分解能で観察することができる。本論文では、将来の研究のためのプラットフォームとして抗菌治療中の集団を評価する方法を詳述する。
Abstract
緑膿菌(Pa)は 嚢胞性線維症(CF)に関連する最も一般的な日和見病原体の1つである。 Pa のコロニー形成が確立されると、感染菌の大部分が気道痰内にバイオフィルムを形成する。CF痰から分離された Pa バイオフィルムは、空間的に組織化され、抗菌耐性などの臨床的に関連する表現型を示す〜10〜1,000個の細胞の小さく密な凝集体で増殖することが示されている。変化する痰環境に Pa 凝集体がどのように反応するかを研究する上で最大の課題の1つは、凝集形成を促進する栄養的に関連性の高い堅牢なシステムの欠如です。合成CF痰培地(SCFM2)を用いて 、Pa 凝集体の寿命を観察するには、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)と単一細胞の分解能での画像解析を用いる。この インビトロ システムは、リアルタイム、3次元、およびミクロンスケールでの様々なサイズの数千の集合体の観察を可能にする。個体レベルおよび集団レベルでは、表現型および位置によって集合体をグループ化する能力を有することは、異なる発達段階での凝集体の観察を容易にし、抗生物質治療などの微小環境の変化に対する応答を精密に区別することを促進する。
Introduction
緑膿菌(Pa)は、免疫障害を持つ個人に慢性感染を確立する日和見病原体です。遺伝性疾患嚢胞性線維症(CF)を有する人にとって、これらの感染症は一生に一度の経過に及ぶ可能性がある。CFは、気道に粘性のある栄養豊富な痰の蓄積を引き起こし、時間の経過とともに様々な微生物病原体によって植民地化される。Paは最も普及しているCF病原体の1つで、幼児期に気道を植民地化し、治療が困難な感染症1を確立する。Paは依然として重大な臨床的問題であり、近年2,3で改善された治療レジメンにもかかわらず、CFを有する人々における死亡率の主要な原因と考えられている。この持続性表現型および抗生物質耐性の増加は、新しい治療戦略の開発のための研究の優先事項として、疾病管理センター(CDC)と世界保健機関(WHO)の両方によって同定された病原体群のPaに位置を獲得している- ESKAPE病原体4。
他のESKAPE病原体と同様に、獲得した抗生物質耐性はPaでは一般的であるが、Pa抗菌耐性に寄与する多くの固有の特性もある。これらの中には、−10〜1,000細胞の凝集高密度クラスターを形成するPaの能力があり、これはCF患者痰5、6を含む複数の感染症で観察することができる。他のバイオフィルムシステムで研究されたPaと同様に、Pa凝集体は、抗生物質に対する耐性の増加や細胞間コミュニケーションの活性化(クォーラムセンシング(QS))などの臨床的に関連する表現型を表示する。例えば、Paの集合体は、他の微生物と戦うとともに、ピオシャニン7の産生などの抗菌治療を容認するためにQS規制行動を使用することが示されている。このような行動を研究する能力は、人体に存在する環境と同様の環境で細菌生態系に関するエキサイティングな洞察を提供します。
変化する痰環境にPa凝集体がどのように反応するかを研究する上で最大の課題の1つは、凝集形成を促進する栄養的に関連性の高い堅牢なシステムの欠如です。Paについて知られていることの多くは、細胞がプランクトニックに成長するインビトロシステムを使用して発見された、または生体内8で観察されていない特徴的な表面に付着した「キノコ」アーキテクチャで発見されている。フローセルや固体寒天などの古典的なバイオフィルム成長モデルは、細菌の挙動と抗生物質耐性のメカニズムに関する広範かつ貴重な知識を生み出していますが、これらの知見は必ずしもin vivoで翻訳されるとは限りません。多くのin vitroモデルは、ヒト感染部位の成長環境を模倣する能力が限られており、生体内研究では高価なコストが必要である。さらに、多くのin vivoモデルは、インビトロ技術によって得られる柔軟性と解像度を欠いている。
合成嚢胞性線維症痰(SCFM2)は、CF肺の慢性感染時に経験したようなPa成長の環境を提供するように設計されている。SCFM2は、ムチン、脂質、およびDNAに加えて、期待CF痰で同定された栄養源を含む。SCFM2のPa成長は、実際の痰の成長に必要なほぼ同一の遺伝子を必要とし、自然なPa凝集形成9、10をサポートする。接種後、プランクトニック細胞は膨張によって大きさが大きくなる凝集体を形成する。個々のセル (移民と呼ばれます) は、集合から解放され、非植民地化された領域に移行され、新しい集合体10を形成します。この生命史は、単一の細胞の解像度でCLSMおよび画像解析を使用して観察することができる。SCFM2で形成されたPaの集合体は、CF肺10で観察されるものと同様のサイズである。このモデルは、リアルタイムで、ミクロンスケールで3次元で様々なサイズの複数の集合体を観察することができます。タイムラプス顕微鏡は、1回の実験で数千個(約50,000)の集合体を追跡することを可能にします。画像解析ソフトウェアを使用することで、個々の集合体レベルと母集団レベルの両方で、3次元の集合体積、表面積、位置を含むマイクログラフの集合式の定量を可能にします。表現型と位置によって集合体をグループ化する能力を有することで、異なる発達段階での凝集体の分化と、変化する微小環境6,11への応答が可能となる。
SCFM2を使用してPa集合体を低容量および高スループットアッセイで研究すると、柔軟で費用対効果の高いモデルになります。定義された媒体として、SCFM2は複数のプラットフォームにわたって均一性および再現性を提供し、vitro9でPa集合体を研究するための栄養的および物理的に関連する方法を提供する。アプリケーションには、CLSMと組み合わせて空間組織と抗生物質耐性を高解像度で観察するアプリケーションが含まれます(この方法の論文で説明したように)。リアルタイムのミクロンスケールのデータを提供する実験を行う能力は、それらが生体内で起こり得る種間および種間相互作用の研究を可能にする。例えば、SCFM2は以前、P.が毒性および病原性に寄与する複数の遺伝子を調節するために利用するシステムのネットワークを介して、集合集団における細胞間コミュニケーションの空間的ダイナミクスを研究するために使用されてきた。
図1: 主な実験工程のグラフィカル描写( A)SCFM2はPa細胞を接種し、ガラス底培養皿に凝集体を形成させる。(B)凝集体を共焦点顕微鏡に移し、抗生物質を加える。描かれているのは、抗生物質治療を伴わない3つの技術的複製(チャンバー1-3)と、接種されたSCFM2のコントロールウェル(4)である。凝集体は、18時間にわたってCLSMを用いて画像化され、(C)初期18時間イメージング後、死細胞を視覚化するためにヨウ化プロピジウムで骨材を処理し、所望の表現型を有する凝集体をFACSを用いてSCFM2から分離する。略語: SCFM2 = 合成嚢胞性線維症痰培地;Pa =緑膿菌CLSM = 共焦点レーザー走査顕微鏡;FACS = 蛍光活性化細胞分類。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ここで、リアルタイムでPa集合体に対する抗生物質治療の影響を研究するSCFM2の有用性が示され、続いて下流分析のための明確な型素型を有する集合体の集団を分離する細胞選別アプローチの使用が示される(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、抗生物質治療の有無において細菌集合体集団を研究するために組み合わせることができる方法論を導入した。高解像度CLSMは、抗生物質にさらされると、凝集バイオマスの変化と、リアルタイムでの凝集物の構造的指向の可視化を可能にします。また、抗生物質による処理後に残るバイオマスの物理的・構造的特徴を定量化し、RNA-seqを用いた将来の遺伝子発現研究とこれらの観?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E.Dは、南フロリダ大学分子医学部のスタートアップ資金と、CFF研究助成金(DARCH19G0)N.I.H(5R21AI147654 – 02(PI、陳))およびUSF微生物叢研究所によって支援されています。ホワイトリー・ラボは、この原稿に関連するデータセットを含む継続的なコラボレーションに感謝します。FACSの選別を促進してくれたチャールズ・シェカーズ博士に感謝します。数字は、Biorender.com を使用してA.D.GとS.E.Dによって作成されました。
Materials
| Amino acids | |||
| Alanine | Acr s Organics |
56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acrs Organics |
56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acrs Organics |
138-15-8 | |
| Glycine | Acrs Organics |
56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acrs Organics |
73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acrs Organics |
63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acrs Organics |
63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acrs Organics |
72-19-5 | |
| Tryptophan | Acrs Organics |
73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acrs Organics |
72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acrs Organics |
7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acrs Organics |
7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acrs Organics |
7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acrs Organics |
12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
Referências
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
