Profilering flygtige forbindelser i solbærfrugt ved hjælp af Headspace Solid-Phase Microextraction Koblet til Gaskromatografi-Mass Spektrometri
Summary
En headspace solid-fase mikroextraction-gas-kromatografi platform er beskrevet her for hurtig, pålidelig og semi-automatiseret flygtig identifikation og kvantificering i modne solbær frugter. Denne teknik kan bruges til at øge viden om frugt aroma og til at vælge sorter med forbedret smag med henblik på avl.
Abstract
Der er en stigende interesse for at måle flygtige organiske forbindelser (VOC), der udledes af modne frugter med henblik på avl af sorter eller sorter med forbedrede organoleptiske egenskaber og dermed for at øge forbrugernes accept. Metabolomiske platforme med høj gennemløb er for nylig blevet udviklet til at kvantificere en bred vifte af metabolitter i forskellige plantevæv, herunder nøgleforbindelser, der er ansvarlige for frugtsmag og aromakvalitet (volatilomics). En metode ved hjælp af headspace solid-fase mikroextraction (HS-SPME) kombineret med gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er beskrevet her til identifikation og kvantificering af VOC’er, der udsendes af modne solbærfrugter, et bær, der er meget værdsat for dets smags- og sundhedsmæssige fordele.
Modne frugter af solbærplanter (Ribes nigrum) blev høstet og direkte frosset i flydende nitrogen. Efter vævs homogenisering for at producere et fint pulver blev prøverne optøet og straks blandet med natriumchloridopløsning. Efter centrifugering blev supernatanten overført til et headspace glasglasglasglas, der indeholdt natriumchlorid. VOC’er blev derefter udvundet ved hjælp af en solid-fase mikroextraction (SPME) fiber og en gaskromatograf koblet til en ion fælde massespektrometer. Flygtig kvantificering blev udført på de resulterende ionkromatogrammer ved at integrere spidsbelastningsområde ved hjælp af en bestemt m/z ion for hver VOC. Korrekt VOC-anmærkning blev bekræftet ved at sammenligne retentionstider og massespektre af rene kommercielle standarder, der kører under de samme betingelser som prøverne. Mere end 60 VOC’er blev identificeret i modne solbærfrugter dyrket i kontrasterende europæiske steder. Blandt de identificerede VOC’er kan vigtige aromaforbindelser, såsom terpenoider og C6-flygtige stoffer, bruges som biomarkører for solbærfrugtkvalitet. Derudover diskuteres fordele og ulemper ved metoden, herunder potentielle forbedringer. Desuden er brugen af kontroller til batchkorrektion og minimering af afdriftsintensitet blevet fremhævet.
Introduction
Smag er et væsentligt kvalitetstræk for enhver frugt, der påvirker forbrugernes accept og dermed væsentligt påvirker omsætteligheden. Smagsopfattelse indebærer en kombination af smags- og olfaktoriske systemer og afhænger kemisk af tilstedeværelsen og koncentrationen af en bred vifte af forbindelser, der akkumuleres i spiselige plantedele, eller i tilfælde af VOC’er, der udsendes af den modne frugt1,2. Mens traditionel avl har fokuseret på agronomiske træk såsom udbytte og skadedyrsresistens, frugt kvalitet træk forbedring, herunder smag, har længe været forsømt på grund af den genetiske kompleksitet og vanskeligheden ved korrekt fænotype disse egenskaber, hvilket fører til forbrugernes utilfredshed3,4. Nylige fremskridt inden for metabolomiske platforme har haft succes med at identificere og kvantificere nøgleforbindelser, der er ansvarlige for frugtsmag og aroma5,6,7,8. Desuden giver kombinationen af metabolitprofilering med genomiske eller transskriptomiske værktøjer mulighed for at belyse den genetik, der ligger til grund for frugtsmagen, hvilket igen vil hjælpe avlsprogrammer med at udvikle nye sorter med forbedrede organoleptiske egenskaber2,4,9,10,11,12,13,14.
Solbær (Ribes nigrum) bær er meget værdsat for deres smag og ernæringsmæssige egenskaber, der dyrkes bredt på tværs af de tempererede zoner i Europa, Asien og New Zealand15. Det meste af produktionen forarbejdes til fødevarer og drikkevarer, som er meget populære i De Nordiske Lande, primært på grund af bærenes organoleptiske egenskaber. Den intense farve og smag af frugten er resultatet af en kombination af anthocyaniner, sukkerarter, syrer og VOC’er til stede i de modne frugter16,17,18. Analysen af solbær flygtige går tilbage til 1960’erne19,20,21. For nylig har flere undersøgelser fokuseret på solbær VOC’er, identificere vigtige forbindelser til frugtaromaopfattelse og vurdering af virkningen af genotype, miljø eller opbevarings- og forarbejdningsforhold på VOC-indhold5,17,18,22,23.
På grund af dens mange fordele er den foretrukne teknik til højgennemsigtigt flygtig profilering HS-SPME/GC-MS24,25. En silica fiber, belagt med en polymer fase, er monteret på en sprøjte enhed, så adsorption af flygtige stoffer i fiberen, indtil en ligevægt fase er nået. Headspace ekstraktion beskytter fiberen mod nonvolatile forbindelser til stede i matrix24. SPME kan med succes isolere et stort antal VOC’er, der er til stede ved meget variable koncentrationer (dele pr. milliard til dele pr. million)25. Derudover er det en opløsningsmiddelfri teknik, der kræver begrænset prøvebehandling. Andre fordele ved HS-SPME er den lette automatisering og dens relativt lave omkostninger.
Dens succes kan dog begrænses, afhængigt af VOC’ernes kemiske karakter, ekstraktionsprotokollen (herunder tid, temperatur og saltkoncentration), prøvestabilitet og tilgængeligheden af tilstrækkeligt frugtvæv26,27. Dette papir præsenterer en protokol for solbær VOC’er isoleret af HS-SPME og analyseret af gaskromatografi kombineret med en ion fælde massespektrometer. Der blev opnået en balance mellem mængden af plantemateriale, prøvestabilitet og varigheden af ekstraktion og kromatografi for at kunne behandle et stort antal solbærprøver, hvoraf nogle blev præsenteret i denne undersøgelse. Navnlig vil VOC-profiler og/eller kromatrammer af fem sorter (»Andega«, »Ben Tron«, »Ben Gairn«, »Ben Tirran« og »Tihope« blive præsenteret og diskuteret som eksempeldata. Desuden er den samme protokol med succes blevet gennemført til VOC-måling hos andre frugtbærarter som jordbær (Fragaria x ananassa), hindbær (Rubusidaeus) og blåbær (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
Avl for frugt aroma har længe været hæmmet af den komplekse genetik og biokemi, der ligger til grund for syntesen af flygtige forbindelser og manglen på teknologier til korrekt phenotyping. Men de seneste fremskridt inden for metabolomiske platforme kombineret med genomiske værktøjer tillader endelig identifikation af de metabolitter, der er ansvarlige for forbrugernes præferencer og for at opdrætte afgrøder med forbedret smag3. Mens de fleste fremskridt er opnået i modellen frugt, <sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación fra University of Malaga for HS-SPME/GC-MS målinger. Vi anerkender Sara Fernández-Palacios Campos’ bistand i forbindelse med flygtig kvantificering. Vi takker også GoodBerry’s konsortium medlemmer for at levere frugt materiale.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
Referências
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
