I dette arbejde beskriver vi de protokoller, der anvendes i repliconbaserede og virale enzymbaserede assays til at screene for hæmmere af zikavirusreplikation i et screeningsformat med høj overførselshastighed.
Antiviral lægemiddelopdagelse kræver udvikling af pålidelige biokemiske og cellulære analyser, der kan udføres i højgennemsigtstvisningsformater (HTS). Flavivirus ikke-strukturelle (NS) proteiner menes at co-translationelt samle på endoplasmic reticulum (ER) membraner, der danner replikation kompleks (RC). NS3 og NS5 er de mest studerede enzymer i RC og udgør de vigtigste mål for lægemiddeludvikling på grund af deres afgørende roller i viral genom replikation. NS3 protease domæne, som kræver NS2B som sin cofaktor, er ansvarlig for kavalergang af den umodne viral polyprotein i de modne NS proteiner, mens NS5 RdRp domæne er ansvarlig for RNA replikation. Heri beskriver vi i detaljer de protokoller, der anvendes i repliconbaserede screeninger og enzymatiske analyser til at teste store sammensatte biblioteker for hæmmere af Zika-virus (ZIKV) replikation. Replikoner er selvreplikerende subgenomiske systemer udtrykt i pattedyrceller, hvor de virale strukturelle gener erstattes af et reporter-gen. De hæmmende virkninger af forbindelser på viral RNA replikation kan let vurderes ved at måle reduktionen i reporter protein aktivitet. De replicon-baserede screeninger blev udført ved hjælp af en BHK-21 ZIKV replicon celle linje udtrykker Renilla luciferase som en reporter gen. For at karakterisere de specifikke mål for identificerede forbindelser etablerede vi in vitro fluorescensbaserede analyser til rekombinant udtrykt NS3 protease og NS5 RdRp. Den virale proteases proteolytiske aktivitet blev målt ved hjælp af det fluorogene peptidsubstrat Bz-nKRR-AMC, mens NS5 RdRp-forlængelsesaktiviteten blev direkte opdaget ved stigningen i det fluorescerende signal fra SYBR Green I under RNA-forlængelse ved hjælp af den syntetiske biotinylerede selvansugende skabelon 3′UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).
Zikavirus (ZIKV) er et spirende leddyrbårent virusmedlem af slægten Flavivirus, som omfatter den nært beslægtede Dengue virus (DENV), japansk encephalitisvirus (JEV) og Yellow Fever-virus (YFV), der udgør konstante trusler mod folkesundheden1. Zikv-udbruddet i 2015-16 i Amerika fik global opmærksomhed efter dets fremkomst i Brasilien på grund af sammenhængen med alvorlige neurologiske lidelser, såsom medfødt ZIKV-associeret mikrocefali hos nyfødte2,3 og Guillain-Barré syndrom hos voksne4. Selv om antallet af smittetilfælde faldt i løbet af de næste to år, blev autoktone myggebårne transmissioner af ZIKV verificeret i 87 lande og territorier i 2019, hvilket viser virussens potentiale til at genopstå som enepidemi 5. Til dato er der ingen godkendte vacciner eller effektive lægemidler mod ZIKV-infektion.
Antiviral lægemiddelopdagelse kræver udvikling af pålidelige cellulære og biokemiske analyser, der kan udføres i HTS-formater (high-throughput screening). Repliconbaserede screeninger og virale enzymbaserede analyser er to værdifulde strategier til at teste småmolekyleforbindelser til hæmmere af ZIKV1. Flavivirus ikke-strukturelle (NS) proteiner menes at co-translationelt samle på endoplasmaiske reticulum (ER) membraner, der danner replikation kompleks (RC)6. NS3 og NS5 er de mest studerede enzymer i RC og udgør de vigtigste mål for lægemiddeludvikling på grund af deres afgørende roller i viral genom replikation. NS3 protease domæne, som kræver NS2B som sin cofaktor, er ansvarlig for kavalergang af den umodne viral polyprotein i de modne NS proteiner, mens NS5 RdRp domæne er ansvarlig for RNA replikation6.
Replikoner er selvreplikerende subgenomiske systemer udtrykt i pattedyrceller, hvor de virale strukturelle gener erstattes af et reporter-gen. De hæmmende virkninger af forbindelser på viral RNA-replikation kan let vurderes ved at måle reduktionen i reporterproteinaktiviteten7. Heri beskriver vi de protokoller, der anvendes til screeningshæmmere af ZIKV-replikationen i et 96-brønds pladeformat. De replicon-baserede assays blev udført ved hjælp af en BHK-21 ZIKV Rluc replicon celle linje, som vi for nylig har udviklet8. For at karakterisere de specifikke mål for identificerede forbindelser etablerede vi in vitro fluorescensbaserede analyser til rekombinant udtrykt NS3 protease ved hjælp af det fluorogene peptidsubstrat, Bz-nKRR-AMC, mens vi for NS5 RdRp målte forlængelsen af den syntetiske biotinylerede selvansende skabelon 3’UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), ved hjælp af det interkalerende farvestof SYBR Green I.
Zikv protease (45-96 restkoncentrationer af NS2B-cofaktor, der er knyttet til restkoncentrationer 1-177 af NS3-proteasedomænet af en glycinrig linker [G4SG4]) blev fremstillet som beskrevet for YFV9, mens polymerase (276-898 rester af RdRp-domæne) blev klonet og udtrykt som beskrevet i10. Begge enzymsekvenser er afledt af GenBank ALU33341.1. Som primære antivirale screeninger testes forbindelser ved 10 μM, og dem, der viser aktiviteter ≥ 80 %, vurderes derefter på en dosisafhængig måde, hvilket resulterer i en effektiv/hæmning (EF50 eller IC50) og koncentrationerne af cytotoksisk (CC50). I forbindelse med repræsentative resultater vises EF50- og CC50-værdierne af NITD008, en kendt flavivirushæmmer11, fra repliconbaserede screeninger. For de enzymatiske analyser vises IC50-værdierne af to forbindelser fra MMV/DNDi Pandemic Response Box, et bibliotek bestående af 400 molekyler med antibakterielle, svampedræbende og antivirale aktiviteter. De protokoller, der er beskrevet i dette arbejde, kan ændres til at screene for hæmmere af andre relaterede flavivirus.
De protokoller, der er beskrevet heri, kunne let tilpasses til screeninger i et 384 eller 1536-brønd-format. For biokemiske og/eller cellebaserede screeninger, der udføres i HTS-format, beregnes Z’s faktorværdi, en statistisk parameter, for hver plade for at sikre følsomheden, reproducerbarheden og nøjagtigheden af disse analyser12. Der forventes en Z’-faktorværdi på 0,5 eller derover for repliconbaserede screeninger, mens der forventes en værdi på 0,7 eller derover for NS3- og NS5-aktivi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID tilskud 2013/07600-3 til GO, tilskud 2018/05130-3 til RSF og 2016/19712-9 til ASG og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (tilskud 88887.516153/2020-00) til ASG. Vi vil gerne takke Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) og initiativet Lægemidler mod oversete sygdomme (DNDi, www.dndi.org) for deres støtte, design af Pandemic Response Box og levering af forbindelserne.
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |