ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ
Summary
本研究では、ハイスループットスクリーニング形式でジカウイルス複製の阻害剤をスクリーニングするための、レビコンベースおよびウイルス酵素ベースのアッセイで使用されるプロトコルについて説明する。
Abstract
抗ウイルス薬の発見は、高スループットスクリーニング(HTS)フォーマットで行うことができる信頼性の高い生化学的および細胞アッセイの開発を必要とします。非構造(NS)タンパク質は、小胞体(ER)膜上で共同翻訳的に組み立てられ、複製複合体(RC)を形成すると考えられている。NS3とNS5はRCの最も研究された酵素であり、ウイルスゲノム複製における重要な役割のために医薬品開発の主な標的となる。NS2Bを補因子とするNS3プロテアーゼドメインは、未熟なウイルス性ポリタンパク質を成熟したNSタンパク質に切断するのに対し、NS5 RdRpドメインはRNA複製を担当します。本明細書において、ジカウイルス(ZIKV)複製の阻害剤に対する大規模な化合物ライブラリーを試験するために、レコンベースのスクリーニングおよび酵素アッセイで使用されるプロトコルについて詳細に説明する。Repliconsは哺乳類細胞で発現する自己複製型サブゲノム系であり、ウイルス構造遺伝子はレポーター遺伝子に置き換えられる。ウイルスRNA複製に対する化合物の阻害効果は、レポータータンパク質活性の低下を測定することによって容易に評価することができる。レプレッサンベースのスクリーニングは、 レニラル シファーゼをレポーター遺伝子として発現するBHK-21 ZIKVリプレコン細胞株を用いて行った。同定された化合物の特異的標的を特徴付けるため、組換えに発現NS3プロテアーゼおよびNS5 RdRp用のイン ビトロ 蛍光ベースアッセイを確立しました。ウイルスプロテアーゼのタンパク質分解活性を、フッ素化ペプチド基質Bz-nKRR-AMCを用いて測定した、 NS5 RdRp伸長活性は、RNA伸長中のSYBRグリーンIの蛍光シグナルの増加によって直接検出された一方で、合成バイオチン化自己プライミングテンプレート3’UTR-U30(5′-ビオチン-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′)を使用した。
Introduction
ジカウイルス(ZIKV)は、フラビウイルス属の新興の節足動物媒介ウイルスメンバーであり、密接に関連するデング熱ウイルス(DENV)、日本脳炎ウイルス(JEV)および黄熱病ウイルス(YFV)を含み、公衆衛生に絶え間ない脅威をもたらす1。2015-16年のアメリカ大陸でのZIKVの流行は、新生児2、3およびギランバレー症候群の先天性ZIKV関連小頭症およびギランバレー症候群などの重度の神経障害との関連により、ブラジルでの出現に続いて世界的な注目を集めた。感染例の数は今後2年間で減少したが、2019年には87の国と地域でZIKVの蚊媒介感染が確認され、ウイルスが流行として再び出現する可能性を証明した。現在までに、ZIKV感染に対する承認されたワクチンや有効な薬物はありません。
抗ウイルス薬の発見は、高スループットスクリーニング(HTS)フォーマットで行うことができる信頼性の高い細胞および生化学的アッセイの開発を必要とします。レプコンベースのスクリーニングとウイルス酵素ベースのアッセイは、ZIKV1の阻害剤に対する低分子化合物を試験するための2つの貴重な戦略である。非構造(NS)タンパク質とは、小胞体(ER)膜上で共翻訳的に組み立てられ、複製複合体(RC)6を形成すると考えられている。NS3とNS5はRCの最も研究された酵素であり、ウイルスゲノム複製における重要な役割のために医薬品開発の主な標的となる。NS2Bを補因子とするNS3プロテアーゼドメインは、未熟なウイルス性ポリタンパク質を成熟したNSタンパク質に切断する一方、NS5 RdRpドメインはRNA複製6を担う。
Repliconsは哺乳類細胞で発現する自己複製型サブゲノム系であり、ウイルス構造遺伝子はレポーター遺伝子に置き換えられる。ウイルスRNA複製に対する化合物の阻害効果は、レポータータンパク質活性7の低下を測定することによって容易に評価することができる。本明細書において、96ウェルプレート形式でのZIKV複製のスクリーニング阻害剤に用いられるプロトコルについて説明する。レパコンベースのアッセイは、我々が最近開発したBHK-21 ZIKV Rluc レパコンセルラインを使用して行われました8.同定された化合物の特異的標的を特徴付けるために、我々は、フッ素化ペプチド基質を用いて組換え発現NS3プロテアーゼに対する インビトロ 蛍光ベースアッセイを確立し、 Bz-nKRR-AMCは、NS5 RdRpの場合、合成バイオチン化自己プライミングテンプレート3’UTR-U30(5′-ビオチン-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCUAAGU-3′)の伸びを測定し、インターカレートダイSYBRグリーンI.
ジKVプロテアーゼ(グリシンリッチリンカー[G4SG4])によってNS3プロテアーゼドメインの残基1〜177に結合したNS2B補因子の45-96残基が得られたが、YFV9に記載されている通り、ポリメラーゼ(RdRpドメインの276-898残基)をクローニングし、10で詳述した。両方の酵素配列は、GenBank ALU33341.1に由来した。一次抗ウイルススクリーニングとして、化合物は10μMで試験され、80%≥活性を示す化合物は用量依存的に評価され、その結果、有効/阻害(EC50またはIC50)および細胞傷害(CC50)濃度が得られます。代表的な結果の文脈では、NITD008のEC50およびCC50値、既知のフラビウイルス阻害剤11、レコンベースのスクリーニングからが示されている。酵素アッセイの場合、抗菌、抗真菌および抗ウイルス活性を有する400分子からなるライブラリーであるMMV/DNDiパンデミック応答ボックスからの2つの化合物のIC50値が示されている。本研究で説明したプロトコルは、他の関連するフラビウイルスの阻害剤をスクリーニングするように変更することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載されているプロトコルは、384または1536-well形式でのスクリーニングに容易に適応することができる。HTS形式で行われる生化学的および/または細胞ベースのスクリーニングの場合、Z’因子値は、統計的パラメータであり、それらのアッセイ12の感度、再現性および正確性を確保するために各プレートについて計算される。レコンベースのスクリーニングでは0.5?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP)、CEPID助成金2013/07600-3によって支援されました。 RSFに2018/05130-3、ASGに2016/19712-9を付与し、COGに対しては、クオルデナソン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニヴェル・スーペリア(助成金88887.516153/2020-00)を付与します。マラリアベンチャーズの医薬品(MMV、www.mmv.org)と放置病治療薬イニシアチブ(DNDi、www.dndi.org)のサポート、パンデミックレスポンスボックスの設計、化合物の供給に感謝します。
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
Referências
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