Ensaios antivirais de alta produtividade para tela para inibidores da replicação do vírus Zika
Summary
Neste trabalho, descrevemos os protocolos usados em ensaios baseados em enzimas cílicas e virais para triagem de inibidores da replicação do vírus Zika em um formato de triagem de alto rendimento.
Abstract
A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios bioquímicos e celulares confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento (HTS). Acredita-se que as proteínas não estruturais do flavivírus (NS) se reúnem co-traduzindo nas membranas de rcúlumes endoplasmáticos (ER), formando o complexo de replicação (RC). O NS3 e o NS5 são as enzimas mais estudadas do RC e constituem os principais alvos para o desenvolvimento de drogas devido aos seus papéis cruciais na replicação do genoma viral. O domínio protease NS3, que requer o NS2B como seu cofator, é responsável pelo decote da imatura poliproteína viral nas proteínas NS maduras, enquanto o domínio NS5 RdRp é responsável pela replicação do RNA. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos usados em triagens baseadas em replicon e ensaios enzimáticos para testar grandes bibliotecas compostas para inibidores da replicação do vírus Zika (ZIKV). Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas, nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade proteica repórter. As triagens baseadas em replicon foram realizadas usando uma linha celular de replicon BHK-21 ZIKV expressando a luciferase de Renilla como um gene repórter. Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios baseados em fluorescência in vitro para protease NS3 e NS5 RdRp recombinantemente expressos. A atividade proteolítica da protease viral foi medida pelo uso do substrato de peptídeo fluorogênico Bz-nKRR-AMC, enquanto a atividade de alongamento do NS5 RdRp foi diretamente detectada pelo aumento do sinal fluorescente do SYBR Green I durante o alongamento do RNA, usando o modelo de auto-priming sintético 3’UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′).
Introduction
O vírus Zika (ZIKV) é um vírus emergente transmitido pelo artrópode do gênero Flavivirus, que inclui o vírus da dengue (DENV) intimamente relacionado, o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus da Febre Amarela (YFV), que representam constantes ameaças à saúde pública1. O surto de ZIKV 2015-16 nas Américas recebeu atenção global após seu surgimento no Brasil devido à associação com doenças neurológicas graves, como a microcefalia congênita associada ao ZIKV em recém-nascidos2,3 e síndrome de Guillain-Barré em adultos4. Embora o número de casos de infecção tenha diminuído ao longo dos dois anos seguintes, as transmissões autóctones transmitidas por mosquitos de ZIKV foram verificadas em 87 países e territórios em 2019, evidenciando, portanto, o potencial do vírus para ressurgir como uma epidemia5. Até o momento, não há vacinas aprovadas ou medicamentos eficazes contra a infecção pelo ZIKV.
A descoberta de medicamentos antivirais requer o desenvolvimento de ensaios celulares e bioquímicos confiáveis que podem ser realizados em formatos de triagem de alto rendimento (HTS). As triagens baseadas em replicon e ensaios baseados em enzimas virais são duas estratégias valiosas para testar compostos de pequenas moléculas para inibidores do ZIKV1. Acredita-se que as proteínas não estruturais (NS) do flavivírus são co-traduzinicamente montadas nas membranas de ânticulo endoplasmático (ER), formando o complexo de replicação (RC)6. O NS3 e o NS5 são as enzimas mais estudadas do RC e constituem os principais alvos para o desenvolvimento de drogas devido aos seus papéis cruciais na replicação do genoma viral. O domínio protease NS3, que requer o NS2B como seu cofator, é responsável pelo decote da imaturo poliproteína viral nas proteínas NS maduras, enquanto o domínio NS5 RdRp é responsável pela replicação do RNA6.
Os replicons são sistemas subgenômicos auto-replicante expressos em células mamíferas, nas quais os genes estruturais virais são substituídos por um gene repórter. Os efeitos inibitórios dos compostos na replicação viral do RNA podem ser facilmente avaliados medindo a redução da atividade proteica repórter7. Aqui, descrevemos os protocolos usados para os inibidores de triagem da replicação ZIKV em um formato de placa de 96 poços. Os ensaios baseados em replicon foram realizados usando uma linha celular BHK-21 ZIKV Rluc replicon que desenvolvemos recentemente8. Para caracterizar os alvos específicos dos compostos identificados, estabelecemos ensaios in vitro baseados em fluorescência para protease NS3 recombinantemente expresso usando o substrato de peptídeo fluorogênico, Bz-nKRR-AMC, enquanto para NS5 RdRp medimos o alongamento do modelo de auto-priming sintético 3’UTR-U30 (5′-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3′), usando o corante intercalante SYBR Green I.
O zikv protease (45-96 resíduos de cofator NS2B ligados a resíduos 1-177 de domínio protease NS3 por um linker rico em glycina [G4SG4]) foi obtido, conforme descrito para YFV9, enquanto a polimerase (276-898 resíduos de domínio RdRp) foi clonada e expressa, conforme detalhado em10. Ambas as sequências enzimáveis foram derivadas do GenBank ALU33341.1. Como triagens antivirais primárias, os compostos são testados a 10 μM e aqueles que mostram atividades ≥ 80% são então avaliados de forma dependente de dose, resultando nas concentrações efetiva/inibição (EC50 ou IC50) e nas concentrações citotóxicas (CC50). No contexto dos resultados representativos, são mostrados os valores EC50 e CC50 de NITD008, um conhecido inibidor de flavivírus11, a partir de triagens baseadas em replicon. Para os ensaios enzimáticos, são mostrados os valores IC50 de dois compostos da Caixa de Resposta Pandêmica MMV/DNDi, uma biblioteca composta por 400 moléculas com atividades antibacterianas, antifúnggicas e antivirais. Os protocolos descritos neste trabalho poderiam ser modificados para triagem de inibidores de outros flavivírus relacionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos aqui descritos poderiam ser prontamente adaptados para exibições em formatos 384 ou 1536-well. Para triagens bioquímicas e/ou baseadas em células realizadas em formato HTS, o valor fator Z, um parâmetro estatístico, é calculado para cada placa para garantir a sensibilidade, reprodutibilidade e precisão desses ensaios12. Um valor fator Z de 0,5 ou mais é esperado para triagens baseadas em replicon, enquanto um valor de 0,7 ou mais é esperado para os ensaios de atividade NS3 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), concessão do CEPID 2013/07600-3 para GO, conceder 2018/05130-3 à RSF e 2016/19712-9 à ASG, e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvenção 88887.516153/2020-00) à ASG. Gostaríamos de agradecer agradecendo à Medicina para a Malária Ventures (MMV, www.mmv.org) e à iniciativa Drogas para Doenças Negligenciadas (DNDi, www.dndi.org) pelo apoio, pelo projeto da Caixa de Resposta Pandêmica e pelo fornecimento dos compostos.
Materials
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | – | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarine) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | – | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
Referências
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