1. सेल तैयारी नोट:: कक्ष प्रकार और इसकी RNA सामग्री के आधार पर, कक्षों की प्रारंभिक संख्या भिन्न हो सकती है. कुल आरएनए के 200-500 μg या पॉली-ए-चयनित आरएनए के 5-7 μg के बीच प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कोशिकाएं हैं। उदाहरण के लिए, 50 x 106 SupT1 कोशिकाओं को फिनोल-आधारित अभिकर्मकों के साथ निष्कर्षण पर कुल आरएनए के लगभग 500 μg उपज चाहिए, और इस प्रकार परीक्षण किए गए प्रत्येक व्यक्तिगत स्थिति के लिए आवश्यक है। प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार कोशिकाओं की आवश्यक संख्या तैयार करें, और इस प्रकार परीक्षण की गई स्थितियों की संख्या (संक्रमण, टाइमपॉइंट्स, उपचार) के अनुसार। यदि प्रयोग का उद्देश्य गैर-संक्रमित कोशिकाओं और एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं को 24 घंटे के संक्रमण के बाद प्राप्त करना है, तो कुल 100 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, आधा गैर-संक्रमित स्थिति के लिए और आधा संक्रमित स्थिति के लिए। 2. आरएनए निष्कर्षण कोशिकाओं से: फिनोल-क्लोरोफॉर्म के साथ आरएनए निष्कर्षण प्रत्येक स्थिति के लिए, कोशिकाओं को इकट्ठा करें (जैसे, 50 x 106) सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा और supernatant को छोड़ दें। प्रत्येक 50 x 106 सेल गोली के लिए फिनोल-आधारित अभिकर्मक के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण। पूर्ण लाइसिस की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लाइस्ड कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या सीधे संसाधित किया जा सकता है।नोट: यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रति ट्यूब 10 x 106 कोशिकाओं के एलीकोट में भी विभाजित किया जा सकता है और अधिक सुविधाजनक भंडारण के लिए फिनोल-आधारित अभिकर्मक के 1 एमएल में lysed किया जा सकता है। क्लोरोफॉर्म का 1 मिलीलीटर जोड़ें और व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 2,000 x g और 4 °C पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। जलीय चरण (ऊपरी चरण) को पिपेट करें और एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। 45° पर ट्यूब angling द्वारा जलीय चरण को स्थानांतरित समाप्त करें और सावधानी से समाधान बाहर pipetting.नोट: जलीय चरण की मात्रा नमूनों के बीच भिन्न हो सकती है, लेकिन नमूने में जोड़े गए क्लोरोफॉर्म की मात्रा के करीब होनी चाहिए (यानी, 1 एमएल)। किसी भी interphase या कार्बनिक परत हस्तांतरण मत करो! फेज-लॉक या फेज-मेकर ट्यूबों का उपयोग इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बना सकता है। जलीय चरण में 100% आणविक ग्रेड आइसोप्रोपेनॉल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। आरएनए वर्षा की अनुमति देने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। अवक्षेपित आरएनए को गोली मारने के लिए 12,000 x g और 4 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। supernatant त्यागें और 75% आणविक जीव विज्ञान ग्रेड इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में आरएनए गोली resuspend. भंवर संक्षेप में। 7,500 x g और 4 °C पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant त्याग. 15 मिनट के लिए गोली को हवा से सुखाएं। RNase मुक्त पानी के 20 μL में गोली resuspend और एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण. आरएनए वसूली को अधिकतम करने के लिए अतिरिक्त 20 μL पानी के साथ खाली ट्यूब को धोएं, और पहले 20 μL मात्रा के साथ पूल करें। एक spectrophotometer के साथ कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें। वायरल कणों से: कॉलम-आधारित वायरल आरएनए निष्कर्षण किट के साथ आरएनए निष्कर्षणनोट: फिनोल-आधारित अभिकर्मक के साथ वायरल कणों से आरएनए निष्कर्षण कम गुणवत्ता वाले वायरल आरएनए और कम गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों में परिणाम देता है। एक स्तंभ-आधारित आरएनए निष्कर्षण इस प्रकार इष्ट होना चाहिए। आरएनए निष्कर्षण किट आरएनए क्षालन और वसूली के लिए वाहक आरएनए का उपयोग कर इस प्रक्रिया के लिए उपयुक्त नहीं हैं और इससे बचा जाना चाहिए। चूंकि एचआईवी आरएनए पॉली-एडेनिलेटेड है, इसलिए आगे एमआरएनए अलगाव के बिना प्रत्यक्ष आरएनए निष्कर्षण MeRIP-Seq और BS-Seq पाइपलाइनों में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त है। आम तौर पर सार्वभौमिक रूप से संक्रमित कोशिकाओं से वायरल supernatant के 1-2 मिलीलीटर पूरे वर्कफ़्लो को करने के लिए पर्याप्त आरएनए प्रदान करना चाहिए। lysis बफर के 30 mL करने के लिए बीटा-mercaptoethanol के 150 μL जोड़कर बफर तैयार करें। 100% इथेनॉल के 96 मिलीलीटर जोड़कर वायरल वॉश बफर का पुनर्गठन करें। सेलुलर आरएनए संदूषण को कम करने के लिए गोली सेल मलबे के लिए वायरस युक्त supernatants और centrifuge ले लीजिए। एक 15 mL ट्यूब के लिए वायरल supernatant के 1 mL स्थानांतरण. वायरल नमूने के 1 मिलीलीटर के लिए वायरल आरएनए बफर के 3 एमएल जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण। एक संग्रह ट्यूब में डाला गया, एक स्तंभ में नमूने के 700 μL स्थानांतरण। कमरे के तापमान पर 13,000 x g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें. 3 पिछले चरणों को दोहराएं जब तक कि पूरे नमूने को संसाधित नहीं किया जाता है, और इस प्रकार सभी आरएनए को सिलिका-आधारित मैट्रिक्स कॉलम पर कब्जा कर लिया गया है। स्तंभ के लिए वायरल वॉश बफ़र के 500 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें. स्तंभ के लिए वायरल वॉश बफ़र के 200 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें. स्तंभ को किसी रिक्त संग्रह ट्यूब में रखें. कमरे के तापमान पर 10,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज आगे किसी भी शेष धोने बफर संदूषक को त्यागने के लिए। ध्यान से एक 1.5 mL ट्यूब में स्तंभ हस्तांतरण. DNase / RNase मुक्त पानी के 20 μL सीधे कॉलम मैट्रिक्स के केंद्र में जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 s के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। DNase / RNase-मुक्त पानी का एक अतिरिक्त 10 μL सीधे कॉलम मैट्रिक्स के केंद्र में जोड़ें और 30 s के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। एक spectrophotometer के साथ कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें।नोट: आरएनए निष्कर्षण किसी भी विधि के साथ किया जा सकता है, यदि पुनर्प्राप्त आरएनए की गुणवत्ता उच्च है, तो आरएनए अखंडता / गुणवत्ता संख्या 9 > के साथ। कुल आरएनए को आगे की प्रक्रिया तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। 3. पॉली द्वारा mRNA अलगाव-Oligo (dT) 25 के साथ एक चयन नोट: सेलुलर अर्क में अत्यधिक मेथिलेटेड राइबोसोमल आरएनए की उपस्थिति के कारण, पॉली-ए आरएनए को या तो आरआरएनए की कमी या पॉली-ए सकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिकता से अलग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। यह चरण वैकल्पिक है और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए केवल सेलुलर आरएनए नमूनों के लिए किया जाना चाहिए। यदि गैर-पॉली-एडेनिलेटेड वायरल आरएनए के मिथाइलेशन का विश्लेषण करते हैं, तो पॉली-ए चयन के बजाय आरआरएनए की कमी का पक्ष लें या अंततः कुल आरएनए पर विश्लेषण करें। पाली-ए कैप्चर के लिए मनका तैयारी oligo (dT)25 चुंबकीय मोती स्टॉक शीशी >30 s के लिए भंवर द्वारा पुन: निलंबित. चुंबकीय मोतियों के 200 μL को 1.5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें। संसाधित किए जाने वाले आरएनए नमूनों की कुल मात्रा के अनुसार चुंबकीय मोतियों के साथ ट्यूबों की संख्या तैयार करें।नोट: डायनाबीड स्टॉक समाधान के 200 μL के साथ एक ट्यूब मोती के 1 मिलीग्राम से मेल खाती है और कुल आरएनए के 75 μg के नमूने को समायोजित कर सकती है। 1 मिनट के लिए एक चुंबक पर ट्यूबों को रखें और supernatant को छोड़ दें। चुंबक से ट्यूबों को हटा दें। बाइंडिंग बफर (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA) के 1 mL जोड़ें, और भंवर द्वारा resuspend। 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूबों जगह और supernatant त्याग. चुंबक से ट्यूबों को हटा दें। दोहराना। बाइंडिंग बफर के 100 μL में धोए गए चुंबकीय मोतियों को फिर से निलंबित करें। कुल आरएनए तैयारी RNase मुक्त पानी के साथ 0.75 μg / μL की अंतिम एकाग्रता पर कुल आरएनए को पतला करें, जो 75 μg / 100 μL से मेल खाती है।नोट:: यदि RNA कम सांद्रता पर है, तो वॉल्यूम को संशोधित किए बिना नीचे वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। प्रति ट्यूब आरएनए नमूने के 100 μL वितरण द्वारा कई ट्यूबों में कुल आरएनए को एलीकोट करें। प्रत्येक आरएनए नमूने के लिए बाइंडिंग बफर के 100 μL जोड़ें। माध्यमिक संरचनाओं को बाधित करने के लिए कुल आरएनए को 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। अगले चरण पर आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर तुरंत रखें।नोट: इनक्यूबेशन समय संसाधित किए जाने वाले नमूनों की संख्या के अनुसार भिन्न हो सकता है, लेकिन किसी भी आरएनए गिरावट से बचने के लिए 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। पॉली-ए चयन प्रत्येक आरएनए ट्यूब (चरण 3.2 से) के लिए, धोए गए चुंबकीय मोतियों के 100 μL जोड़ें (चरण 3.1 से)। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक घूर्णन पहिया पर बाध्यकारी की अनुमति दें। सभी ट्यूबों को खोलें, उन्हें 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें, और ध्यान से सभी supernatant को हटा दें। एक नई ट्यूब में supernatant पुनर्प्राप्त करें और आरएनए कैप्चर (चरण 3.3.14) के दूसरे दौर के लिए एक तरफ रखें, ताकि पॉली-ए अंतिम वसूली में सुधार किया जा सके। चुंबक से ट्यूब निकालें और धोने बफर के 200 μL जोड़ें (10 mM Tris-HCl, पीएच 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA). 4 से 5 बार सावधानी से पिपेट करके मिलाएं। 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब रखें और supernatant त्याग. धोने के चरण को एक बार दोहराएं (चरण 3.3.5 और 3.3.6 को दोहराएं)। मोतियों से पॉली-ए आरएनए को एल्यूट करने के लिए बर्फ-ठंडे 10 mM Tris-HCl के 20 μL जोड़ें। 2 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। चुंबक पर ट्यूब जगह और जल्दी से एक नई RNase मुक्त ट्यूब के लिए पॉली-ए आरएनए युक्त supernatant हस्तांतरण. ट्यूब को बर्फ पर रखें। उपज को बढ़ाने के लिए क्षालन चरण (चरण 3.3.8 से 3.3.10) को दोहराएँ। धोने बफर के 200 μL के साथ एक ही मोती एक बार धो लें। 4 से 5 बार सावधानी से पिपेट करके मिलाएं। 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें और वॉशिंग बफर को छोड़ दें। मोतियों के लिए चरण 3.3.4 से flowthrough जोड़ें और क्षालन के लिए बाध्यकारी से प्रक्रिया को दोहराएँ (चरण 3.3.2 से 3.3.10)। आरएनए eluates अभी के लिए अलग ट्यूबों में रखें।नोट:: वैकल्पिक रूप से, फिर से supernatant चरण 3.3.4 के बराबर एक नई ट्यूब में रखें क्योंकि इसे एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है। प्रक्रिया के अंत में, इथेनॉल वर्षा द्वारा या पसंद की एक स्तंभ-आधारित विधि (यानी, आरएनए स्वच्छ और सांद्रक) के साथ आरएनए को शुद्ध और केंद्रित करें। यह नमूना एक पॉली-ए-समाप्त आरएनए नमूने से मेल खाता है और इसका उपयोग बिसल्फाइट रूपांतरण (चरण 8.2.2) के लिए एक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ एल्यूटेड आरएनए को मापें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए 2 μL ऐलीकोट रखें।नोट: पॉली-ए आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर तब तक संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि आवश्यकता न हो। 4. आरएनए वर्कफ़्लो सेलुलर पॉली-ए आरएनए (एमआरएनए) और वायरल आरएनए नमूनों को 2 एलीकोट में विभाजित करें, जो संबंधित एपिट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण पाइपलाइन को समर्पित है:(i) सेलुलर mRNA के 5 μg या MeRIP-Seq और इनपुट नियंत्रण के लिए वायरल RNA के 1 μg (चरण 5 से 7, और चरण 9 पर जाएं)।(ii) बीएस-सेक के लिए सेलुलर एमआरएनए का 1 μg या वायरल आरएनए का 500 एनजी (चरण 8 और 9 पर जाएं)। 5. आरएनए विखंडन नोट: आरएनए विखंडन आरएनए विखंडन अभिकर्मक के साथ किया जाता है और MeRIP-Seq और आरएनए नमूनों को नियंत्रित करने के लिए अभिप्रेत है। यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है कि 100-200 nt के बीच रेंज के टुकड़े प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता है। mRNA के कुल आयतन को 0.2 mL PCR ट्यूबों में विभाजित करें, जिसमें mRNA/tube का 18 μL है।नोट: जल्दी से काम करें। पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए एक समय में 8 से अधिक नमूनों के साथ काम न करें। वॉल्यूम को स्केल करने से एक पुन: प्रस्तुत करने योग्य और समान विखंडन की गारंटी नहीं होगी। 70 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मोसाइकिलर को गर्म करें। प्रत्येक पीसीआर ट्यूब के किनारे पर विखंडन अभिकर्मक के 2 μL जोड़ें। ट्यूब को बंद करें और नीचे स्पिन करें (ताकि अभिकर्मक 8 ट्यूबों के लिए एक ही समय में आरएनए के संपर्क में आ जाए)। पहले से गर्म thermocycler में 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट नमूनों incubate. जैसे ही इनक्यूबेशन खत्म हो जाता है, प्रत्येक ट्यूब में स्टॉप समाधान के 2 μL को जल्दी से जोड़ें। नीचे स्पिन करें और अगले चरण पर आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर बैठें।नोट: इनक्यूबेशन समय संसाधित किए जाने वाले नमूनों की संख्या के अनुसार भिन्न हो सकता है, लेकिन किसी भी आरएनए गिरावट से बचने के लिए 1 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। सभी नमूनों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं (यदि 8 से अधिक एलीकोट हैं)। ट्यूबों को एक साथ पूल करें और एक आरएनए क्लीन और कंसंट्रेटर किट (चरण 6) या किसी भी अनुकूलित कॉलम-आधारित किट के साथ आरएनए शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ें ताकि बफर से छुटकारा मिल सके और पानी में साफ खंडित आरएनए को पुनर्प्राप्त किया जा सके। 6. आरएनए शुद्धिकरण नोट: इस चरण को इथेनॉल वर्षा द्वारा या किसी भी प्रकार के कॉलम-आधारित आरएनए शुद्धिकरण और एकाग्रता विधि (यानी, आरएनए क्लीन और कंसंट्रेटर) के साथ किया जा सकता है। DNase /RNase-मुक्त पानी के 50-75 μL की कुल मात्रा में शुद्ध आरएनए को एल्यूट या फिर से निलंबित कर दिया।नोट:: यदि कोई स्तंभ-आधारित विधि का उपयोग किया जाता है, तो अधिकतम पुनर्प्राप्ति सुनिश्चित करने के लिए क्षालन के दो दौर दृढ़ता से अनुशंसित हैं। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध खंडित एमआरएनए को मापें और एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें। पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए इनपुट नियंत्रण के रूप में खंडित mRNA के 100 ng रखें (चरण 9 पर जाएं)। शेष खंडित mRNA (न्यूनतम 2.5 μg) MeRIP के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चरण 7.2 पर जाएँ)। 7. MeRIP नोट: प्रत्येक immunoprecipitation (आईपी) के लिए खंडित mRNA के न्यूनतम 2.5 μg की आवश्यकता होती है, या तो एक विशिष्ट एंटी-m6A एंटीबॉडी (परीक्षण की स्थिति) का उपयोग करके या एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी (नकारात्मक नियंत्रण) का उपयोग करके। चुंबकीय मनका Immunoprecipitation के लिए तैयारी प्रत्येक नमूने के लिए, 3.2 मिलीलीटर न्यूक्लिएज-मुक्त पानी के साथ 3.2 मिलीलीटर के साथ mRNA IP बफर 5x (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 750 mM NaCl, 0.5% Igepal CA-630, और न्यूक्लिएज-मुक्त पानी) के 800 μL को पतला करके एक नई शंक्वाकार ट्यूब में 1x IP बफर के 4 mL तैयार करें।नोट: कम से कम 2 प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता है (एक परीक्षण और एक IgG नियंत्रण)। ट्यूब को बर्फ पर रखें। वांछित आईपी प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की उचित संख्या को लेबल करें:एंटी-एम 6 ए एंटीबॉडी के लिए एन ट्यूब (परीक्षण)।सामान्य माउस IgG के लिए एन ट्यूब (नकारात्मक नियंत्रण). चुंबकीय मोतियों (जैसे, Magna CHIP प्रोटीन ए / जी) को उलटा और भंवर द्वारा फिर से निलंबित कर दिया। मोतियों का कोई झुरमुट दिखाई नहीं देना चाहिए। प्रत्येक प्रतिक्रिया की योजना के लिए, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चुंबकीय मोतियों के 25 μL स्थानांतरित करें। उपयोग किए गए मोतियों की मूल मात्रा के संबंध में दस गुना अधिक 1x आईपी बफर (चरण 7.1.1 से) जोड़ें (यानी, चुंबकीय मोतियों के प्रति 25 μL प्रति 25 μL 1x IP बफर के 250 μL)। पूर्ण resuspension के लिए धीरे से ऊपर और नीचे कई बार pipetting द्वारा मोतियों मिश्रण. ट्यूब को चुंबकीय विभाजक पर 1 मिनट के लिए रखें। निकालें और supernatant त्याग, सुनिश्चित करें कि किसी भी चुंबकीय मोतियों aspirate नहीं करने के लिए। चुंबक से ट्यूब निकालें। धोने के चरण को दोहराएँ (चरण 7.1.6 से 7.1.9)। चुंबकीय मोतियों की मूल मात्रा के प्रति 25 μL प्रति 1x IP बफर के 100 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें। चुंबकीय मोतियों की मूल मात्रा के प्रति 25 μL प्रति एंटीबॉडी (1 μg / μL) के 5 μL जोड़ें।एंटी-एम 6 ए एंटीबॉडी (क्लोन 17-3-4-1) [1 μg / μL] के साथ एन ट्यूब (परीक्षण)।सामान्य माउस IgG (1 μg/ μL) के साथ n ट्यूब (ऋणात्मक नियंत्रण). चुंबकीय मोतियों के साथ एंटीबॉडी के संयुग्मन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए घूर्णन पहिया पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब को चुंबकीय विभाजक पर 1 मिनट के लिए रखें। supernatant को छोड़ दें। चुंबक से ट्यूब निकालें और 1x आईपी बफर के 100 μL में एंटीबॉडी मनका मिश्रण resuspend. आरएनए Immunoprecipitation (RIP) प्रत्येक 2.5 μg mRNA नमूने के लिए RIP प्रतिक्रिया मिश्रण के 500 μL को निम्नानुसार तैयार करें: खंडित आरएनए के 100 μL में 2.5 μg (चरण 6.12 से); न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 295 μL; 40 U/μL RNase Inhibitor के 5 μL; और 5x आईपी बफर के 100 μL. प्रत्येक एंटीबॉडी-मनका मिश्रण में आरआईपी प्रतिक्रिया मिश्रण के 500 μL जोड़ें (~ चरण 7.1.14 से ~ 100 μL)। मोतियों को पूरी तरह से पुन: निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे कई बार पिपेटिंग करके मिलाएं। बर्फ पर रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर सभी आरआईपी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। कैप और ट्यूब पक्षों से तरल बूंदों को नीचे स्पिन करने के लिए MeRIP प्रतिक्रियाओं को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूबों को 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर रखें। एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में supernatant स्थानांतरण, सावधान चुंबकीय मोतियों को परेशान नहीं किया जा रहा है.नोट:: Flowthrough RIP दक्षता सत्यापित करने के लिए नियंत्रण के रूप में रखा जा सकता है (चरण 7.3.9 पर जाएँ)। चुंबक से ट्यूबों को निकालें। ठंडे 1x आईपी बफर के 500 μL जोड़कर मोतियों को धोएं। मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित करने के लिए कई बार धीरे-धीरे पिपेटिंग करके मोतियों को मिलाएं। 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर ट्यूबों को रखें और supernatant को छोड़ दें। धोने की प्रक्रिया को दोहराएं (चरण 7.2.6-7.2.7) कुल 3 धोने के लिए दो बार। ट्यूबों को बर्फ पर रखें और तुरंत क्षालन के लिए आगे बढ़ें। क्षालन न्यूक्लिएज मुक्त पानी के 1.3 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate सोडियम नमक (m6A) को भंग करके 20 mM m6A समाधान तैयार करें। 150 μL ऐलीकोट तैयार करें और -20 °C पर स्टोर करें। प्रत्येक नमूने (परीक्षण और नियंत्रण) के लिए: निम्नलिखित घटकों को मिलाकर 225 μL क्षालन बफर तैयार करें: 5x IP बफर के 45 μL, 20 mM m6A के 75 μL, 40U / μL RNase Inhibitor के 3.5 μL, और न्यूक्लिएज-मुक्त पानी के 101.5 μL। मोतियों (चरण 7.2.9 से) के लिए (चरण 7.3.2 से) क्षालन बफर के 100 μL जोड़ें। पूरी तरह से फिर से निलंबित मोतियों के लिए कई बार धीरे-धीरे पिपेटिंग करके मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर पर लगातार मिलाते हुए 1 ज के साथ सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। कैप और ट्यूब पक्षों से तरल बूंदों को नीचे स्पिन करने के लिए आरआईपी प्रतिक्रियाओं को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। ट्यूबों को 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर रखें। एक नए 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए eluted आरएनए टुकड़े युक्त supernatant स्थानांतरण। ध्यान रखें कि मोतियों को एस्पिरेट न करें, क्योंकि यह पृष्ठभूमि शोर को बढ़ाएगा। फिर से 100 μL क्षालन बफर को जोड़कर, 4 °C पर 1 h incubating, और चुंबकीय अलगाव के बाद eluate इकट्ठा करके क्षालन चरणों (7.3.3 से 7.3.6) को दोहराएं। एक ही नमूने से सभी eluates गठबंधन (कुल क्षालन मात्रा 200 μL होना चाहिए). इथेनॉल वर्षा द्वारा या पसंद की एक स्तंभ-आधारित विधि (यानी, आरएनए क्लीन और कंसंट्रेटर) द्वारा एल्यूटेड आरएनए और फ्लोथ्रू (वैकल्पिक, चरण 7.2.5 से) को शुद्ध करें। एक उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने किट का उपयोग कर एक टुकड़ा विश्लेषक के साथ आरएनए मात्रा और flowthrough और eluted नमूनों की गुणवत्ता का आकलन करें। यदि आरएनए की गुणवत्ता संतोषजनक है, तो पुस्तकालय की तैयारी और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (चरण 9) पर आगे बढ़ें।नोट: MeRIP पर पुनर्प्राप्त आरएनए की मात्रा बहुत कम है, और अनिवार्य रूप से परिमाणीकरण सुनिश्चित करने के लिए उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने किट की आवश्यकता होती है। यदि कोई बायोएनालिजर उपलब्ध नहीं है, तो पुस्तकालय की तैयारी के लिए आंख मूंदकर आगे बढ़ना संभव है। 8. आरएनए Bisulfite रूपांतरण नियंत्रण और अभिकर्मक तैयारी ईआरसीसी मिश्रण स्पाइक-इन नियंत्रण: निर्माता के निर्देशों के बाद ईआरसीसी मिश्रण जोड़ें, जो एमआरएनए के 500 एनजी के लिए 0.5 μL अनडिल्यूटेड ईआरसीसी मिश्रण के अतिरिक्त की सिफारिश करते हैं। यह नियंत्रण बिसल्फाइट रूपांतरण की दक्षता का आकलन करने में मदद कर सकता है। स्पाइक पॉली-ए-समाप्त आरएनए (चरण 3.3.14 से) 1/1000 के अनुपात में (यानी, एमआरएनए के 500 एनजी के लिए पॉली-ए-समाप्त आरएनए के 500 पीजी)। यह नमूना राइबोसोमल आरएनए में समृद्ध है और इस प्रकार इसमें 28 एस आरआरएनए होना चाहिए, जो बिसल्फाइट रूपांतरण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण है।नोट: कुल आरएनए का उपयोग पॉली-ए-समाप्त आरएनए के बजाय सकारात्मक नियंत्रण के रूप में भी किया जा सकता है। एक आरएनए मिथाइलेशन किट (जैसे, Zymo EZ) के साथ bisulfite रूपांतरण निष्पादित करें। आरएनए वॉश बफर: उपयोग से पहले आरएनए वॉश बफर ध्यान के 12 एमएल में 100% इथेनॉल (या 95% इथेनॉल का 52 एमएल) के 48 मिलीलीटर जोड़ें। Bisulfite रूपांतरणनोट: बिसल्फाइट रूपांतरण एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए बिसल्फाइट रूपांतरण किट के साथ किया गया था, जैसा कि नीचे बताया गया है निर्माता की प्रक्रिया का पालन किया गया था। 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में, 1000 एनजी एमआरएनए (या 300 और 1000 एनजी के बीच) जोड़ें। स्पाइक-इन नियंत्रण जोड़ें: ईआरसीसी मिश्रण के 1 μL (चरण 8.1.1) और पॉली-ए-समाप्त आरएनए के 1000 पीजी (चरण 8.1.2)। DNase / RNase मुक्त पानी के साथ 20 μL तक की पूरी मात्रा। प्रत्येक 20 μL आरएनए नमूने के लिए आरएनए रूपांतरण अभिकर्मक के 130 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा नमूना मिश्रण. यह सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में नीचे स्पिन करें कि ट्यूब की टोपी या किनारों में कोई बूंदें नहीं हैं। पीसीआर ट्यूबों को एक थर्मल साइकलर में रखें और निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें: 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण; 45 मिनट के लिए 54 डिग्री सेल्सियस पर रूपांतरण; कुल 3 चक्रों के लिए विकृतीकरण और रूपांतरण चरणों को दोहराएँ; और फिर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।नोट: विकृतीकरण और bisulfite रूपांतरण के तीन चक्र नमूने के पूर्ण bisulfite रूपांतरण सुनिश्चित करते हैं। नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या सीधे संसाधित किया जा सकता है। इन-कॉलम डीसल्फोनेशन के साथ आगे बढ़ें। एक खाली संग्रह ट्यूब में एक स्तंभ रखें और स्तंभ के लिए आरएनए बाइंडिंग बफ़र के 250 μL जोड़ें। नमूना लोड (~ 150 μL से चरण 8.2.5 से) आरएनए बाइंडिंग बफर युक्त स्तंभ में और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. स्तंभ में नमूना-आरएनए बाइंडिंग बफर मिश्रण के लिए 95-100% इथेनॉल के 400 μL जोड़ें। कैप को बंद करें और तुरंत कॉलम को कई बार उलटकर मिलाएं। 30 s के लिए पूर्ण गति (≥ 10,000 x g) पर सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें. कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 200 μL जोड़ें और 30 s के लिए पूर्ण गति से सेंट्रीफ्यूज करें। कॉलम के लिए आरएनए Desulphonation बफर के 200 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, 30 सेकंड के लिए पूर्ण गति से सेंट्रीफ्यूज। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें. कॉलम में आरएनए वॉश बफर के 400 μL जोड़ें और 30 s के लिए पूर्ण गति से सेंट्रीफ्यूज करें। आरएनए वॉश बफ़र के अतिरिक्त 400 μL के साथ धोने के चरण को दोहराएँ। फ़्लोथ्रू को छोड़ दें. 2 मिनट के लिए पूर्ण गति से खाली संग्रह ट्यूब में स्तंभ सेंट्रीफ्यूज. एक RNase मुक्त ट्यूब में स्तंभ स्थानांतरण. कॉलम मैट्रिक्स ≥ सीधे DNase / RNase मुक्त पानी के 10 μL जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 30 s के लिए पूर्ण गति से centrifuge.नोट: हम आमतौर पर 20 μL की मात्रा में elute. एल्यूटेड आरएनए का तुरंत उपयोग किया जा सकता है या 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। आरएनए गुणवत्ता और मात्रा के टुकड़ा विश्लेषक मूल्यांकन के लिए 2.5 μL निकालें और पुस्तकालय की तैयारी और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (चरण 9) के लिए आगे बढ़ें। दक्षता के bisulfite रूपांतरण नियंत्रण के लिए परिवर्तित आरएनए के 4 μL ले लो (चरण 8.3). आरटी-पीसीआर द्वारा बिसल्फाइट रूपांतरण नियंत्रणनोट:: यह चरण सुनिश्चित करता है कि bisulfite रूपांतरण अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ने से पहले सफल था। होमो सेपियन्स से 28एस राइबोसोमल आरएनए का उपयोग आरएनए मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाएगा, क्योंकि स्थिति 4447 (जेनबैंक परिग्रहण # NR_003287) पर सी अवशेषों को 100% मेथिलेटेड होने के रूप में वर्णित किया गया है।प्राइमर अनुक्रम:एच 28SF प्राइमर: 5′-GGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGG-3’एच 28SR प्राइमर: 5′-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3′ एक उच्च क्षमता cDNA रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग कर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। बर्फ पर किट घटकों को पिघलाएं और बर्फ पर आरटी मास्टर मिश्रण तैयार करें जैसा कि निम्नानुसार है:Bisulfite के 4 μL परिवर्तित आरएनए (चरण 8.2.14 से):10xRT बफर के 2 μL25x dNTP मिश्रण के 0.8 μL [100 mM]10x RT रैंडम प्राइमरों के 2 μLMultiScribe रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 μLRNase Inhibitor के 1 μLन्यूक्लिएज मुक्त H2O के 9.2 μLनोट: प्रत्येक RT प्रतिक्रिया में 0.2 mL PCR ट्यूबों में 20 μL अंतिम मात्रा होनी चाहिए। निम्नलिखित आरटी कार्यक्रम के साथ थर्मल साइकलर में ट्यूबों को रखो: 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस; 120 मिनट के लिए 37 °C; 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस; फिर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। पीसीआर प्रूफरीडिंग एंजाइम के साथ विशेष रूप से 28 एस आरआरएनए को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करें। बर्फ, धीरे भंवर और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज पर किट घटकों को पिघलाएं। बर्फ पर या बर्फ-ठंडे धातु प्लेट धारक पर पीसीआर मास्टर मिश्रण को निम्नानुसार तैयार करें:10 μM H 28SF प्राइमर का 0.6 μL10 μM H 28SF प्राइमर का 0.6 μLटेम्पलेट cDNA के 6.5 μLडीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण के 22.5 μLनोट: प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में 20 μL अंतिम मात्रा होनी चाहिए। निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम के साथ थर्मल साइकलर में ट्यूबों को रखें: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; विकृतीकरण के 45 चक्र (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस), एनीलिंग (30 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस), और बढ़ाव (15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस), 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम बढ़ाव, और फिर अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ना। एक 2% agarose जेल पर प्रतिक्रिया के 10 μL चलाएँ. अपेक्षित बैंड का आकार 130 – 200 बीपी है। PCR उत्पादों का अनुक्रमण एंजाइमों और dNTP अवशेषों को हटाने के लिए पसंद की एक स्तंभ आधारित विधि के साथ पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें और DNase / RNase मुक्त पानी के कम से कम 20 μL में प्रवर्धित डीएनए को बाहर निकालें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध डीएनए को मापें। अनुक्रमण प्रतिक्रिया पीसीआर उत्पाद / अनुक्रमण प्रतिक्रिया के 40 एनजी का उपयोग करें। H 28SF और H 28SR प्राइमरों के साथ दोनों दिशाओं में अनुक्रम। अनुक्रमों को ज्ञात गैर-कनवर्ट किए गए अनुक्रम (28S राइबोसोमल N5 (RNA28SN5) के साथ संरेखित करें. स्थिति C4447 पर एक सी अवशेषों की उपस्थिति के लिए जाँच करें, और कहीं और सी के बजाय टी अवशेषों के लिए। 9. पुस्तकालय की तैयारी और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण MRNA किट (जैसे, Illumina TruSeq फंसे हुए) का उपयोग करके अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार करें, Elute-Prime-Fragment चरण पर प्रोटोकॉल शुरू करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। हालांकि, इनपुट RNA-Seq और MeRIP-Seq नमूनों के लिए, नमूनों को 80 °C पर 2 मिनट के लिए केवल प्राइम के लिए इनक्यूबेट करें, लेकिन उन्हें आगे टुकड़ा न करें। Illumina प्लेटफार्मों का उपयोग कर अनुक्रमण बाहर ले जाएँ. अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं को वरीयताओं और प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार किया जा सकता है, या तो एकल या युग्मित छोर, न्यूनतम 100 एनटी लंबाई के साथ। 10. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण m6A डेटा प्रोसेसिंग M6A में पढ़ने की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए FASTQC24 चलाएँ और अनुक्रमण से FASTQ फ़ाइलों को इनपुट करें। पढ़ने से कम गुणवत्ता वाले अंत और एडाप्टर अनुक्रमों को ट्रिम करने के लिए Atropos25 चलाएँ। एट्रोपोस चलाने में निम्न पैरामीटर सेट करें। निम्न एडाप्टर अनुक्रमों को निकालें: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT। निम्न Phred गुणवत्ता कटऑफ का उपयोग करें: 5, निर्माता द्वारा निर्दिष्ट के रूप में कम गुणवत्ता वाले सिरों को ट्रिम करने के लिए (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html). ट्रिमिंग के बाद निम्न न्यूनतम पठन लंबाई का उपयोग करें: 25 आधार जोड़े। GRh38 मानव जीनोम और एचआईवी [एकीकृत रैखिक pNL4-3Env-GFP] संदर्भ को FASTA प्रारूप में मर्ज करें। HISAT226 के साथ मर्ज किए गए संदर्भ को अनुक्रमित करें. अनुक्रमित संदर्भ में संरेखित करने के लिए छंटनी की गई पठन पर HISAT2 चलाएँ। डिफ़ॉल्ट HISAT पैरामीटर का उपयोग करें। सॉर्ट करें और संरेखित अनुक्रमणिका SAMtools27 के साथ पढ़ता है. अनुक्रमित पुस्तकालयों के बाद संरेखण गुणवत्ता की जाँच के लिए SAMtools स्टेट और Qualimap 228 चलाएँ। वैकल्पिक रूप से, multiQC29 के साथ पिछले चरण से गुणवत्ता उपायों को इकट्ठा और सारांशित करें। एचआईवी जीनोम में 5 ‘एलटीआर और 3’ एलटीआर में होमोलोगस 634 बीपी अनुक्रम हैं: रियलिग्न मल्टीमैपिंग 5 ‘एलटीआर से एसएएमटीओल्स के साथ संबंधित 3 ‘एलटीआर क्षेत्र में पढ़ता है। M6A चोटियों की पहचान करने के लिए, पीक कॉलिंग सॉफ़्टवेयर MACS230 (v 2.1.2) चलाएं। ध्यान से MACS2 चल रहे पैरामीटर का चयन करें, ताकि RNA-Seq डेटा पर सही कामकाज सुनिश्चित किया जा सके क्योंकि पीक कॉलिंग जीन अभिव्यक्ति स्तर से प्रभावित हो सकती है, और छोटे एक्सोन को चोटियों के रूप में गलत कहा जा सकता है। इसलिए, इनपुट सिग्नल को m6A सिग्नल से घटाया जाना चाहिए, बिना MACS2 द्वारा नियमित रूप से डीएनए आधारित डेटा पर लागू किए गए स्मूथिंग के बिना। MACS2 से ‘callpeak’ उप-आदेश के लिए निम्न पैरामीटर लागू करें:-keep-dup ऑटो (डुप्लिकेट पढ़ने की ओर MACS2 व्यवहार को नियंत्रित करता है, ‘ऑटो’ MACS को पी-वैल्यू कटऑफ के रूप में 1e-5 का उपयोग करके द्विपद वितरण के आधार पर सटीक उसी स्थान पर पढ़ने की अधिकतम संख्या की गणना करने की अनुमति देता है)-g 2.7e9 (बीपी में मानव जीनोम का आकार)-q 0.01 (महत्वपूर्ण चोटियों को कॉल करने के लिए न्यूनतम FDR कटऑफ)-nomodel (शिफ्टिंग मॉडल, जो CHIP-Seq प्रयोगों के लिए सिलवाया जाता है के निर्माण बाईपास करने के लिए)-slocal 0-llocal 0 (यह और 0 करने के लिए पिछले पैरामीटर की स्थापना MACS2 सीधे घटाने के लिए अनुमति देता है, चिकनाई के बिना, इनपुट m6A से पढ़ता है पढ़ता है)-extsize 100 (बीपी में टुकड़ों की औसत लंबाई)-B विभेदक चोटी MACS2 के उप-कमांड कॉल, ‘bdgdiff’ संक्रमित बनाम गैर संक्रमित नमूनों की तुलना करने के लिए चलाएँ। ‘bdgdiff’ इनपुट के रूप में पिछले चरण में ‘callpeak’ द्वारा उत्पन्न bedGraph फ़ाइलों के रूप में लेता है. प्रत्येक समय बिंदु के लिए, ‘bdgdiff’ के साथ संक्रमित बनाम गैर-संक्रमित नमूनों की तुलना चलाएं, m6A सिग्नल से संबंधित इनपुट सिग्नल को घटाएं और अतिरिक्त पैरामीटर प्रदान करें: -g 60 -l 120। m5C डेटा प्रोसेसिंग Cutadapt31 चलाएँ निम्न पैरामीटर के साथ, कच्चे पठन से एडाप्टर अनुक्रम ट्रिम करने के लिए:एडाप्टर “AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC”-न्यूनतम लंबाई = 25. रिवर्स-पूरक seqkit32 का उपयोग करके छंटनी की गई पढ़ता है, क्योंकि अनुक्रमण प्रोटोकॉल रिवर्स स्ट्रैंड से पढ़ता है। पढ़ने की गुणवत्ता की जांच करने के लिए FastQC चलाएँ। GRh38 मानव जीनोम और एचआईवी [एकीकृत रैखिक pNL4-3Env-GFP] FASTA प्रारूप में संदर्भ मर्ज करें। meRanTK package33 से अनुप्रयोग meRanGh के साथ मर्ज किए गए संदर्भ को अनुक्रमित करें। निम्न पैरामीटर के साथ meRanGh के साथ संरेखित करें:-UN को सक्षम करने के लिए unmapped पढ़ता है आउटपुट फ़ाइलों के लिए लिखा जा करने के लिए-MM सक्षम बहु-मैप किया गया पढ़ता है आउटपुट फ़ाइल के लिए लिखा जा करने के लिएbedGraph में आउटपुट के लिए -bg-mbgc 10 फ़िल्टर कवरेज द्वारा क्षेत्र की सूचना दी (कवरेज के कम से कम 10 पढ़ता है) एचआईवी जीनोम में 5 ‘एलटीआर और 3’ एलटीआर में होमोलोगस 634 बीपी अनुक्रम होते हैं: एसएएमटीओएलएस के साथ संबंधित 3 ‘एलटीआर क्षेत्र में 5 ‘एलटीआर से मल्टीमैपिंग पढ़ता है। चलाएँ मिथाइलेशन meRanCall उपकरण के माध्यम से बुला, meRanTK द्वारा प्रदान की, निम्नलिखित मापदंडों के साथ:-rl = 126, पढ़ने की लंबाई-ei = 0.1, मेथिलिकरण दर p-मान गणना के लिए त्रुटि अंतराल-cr = 0.99, अपेक्षित रूपांतरण प्रत्येक नमूने के आकार कारकों का अनुमान लगाने के लिए MeRanTK की उपयोगिता estimateSizeFactors.pl चलाएँ। आकार कारकों को अगले चरण में पैरामीटर के रूप में उपयोग किया जाएगा। समय बिंदु 12, 24, और 36h में गैर-संक्रमित बनाम संक्रमित बनाम के विभेदक मेथिलिकरण विश्लेषण के लिए MeRanCompare चलाएँ। निम्न पैरामीटर लागू किए जाते हैं: पिछले चरण से रिपोर्टिंग और आकार कारकों के लिए न्यूनतम थ्रेशोल्ड के रूप में .01 का एक महत्व मान.