Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.
Het succes van steriele of incompatibele op insectentechnieken gebaseerde populatieonderdrukkingsprogramma’s hangt af van het vermogen van vrijgelaten mannetjes om te concurreren om vrouwtjes van het wilde type en steriliteit in de doelpopulatie te induceren. Daarom is laboratoriumbeoordeling van het concurrentievermogen van de mannelijke paring essentieel voor het evalueren van de geschiktheid van de vrijgavestam vóór veldafgifte. Conventioneel wordt een dergelijke test uitgevoerd door het bepalen van het aandeel levensvatbare eieren dat door de vrouwtjes wordt geproduceerd nadat ze tegelijkertijd zijn blootgesteld aan twee sets mannetjes (wild-type en release-stammen) voor copulatie. Dit proces is echter tijdrovend en arbeidsintensief vanwege de noodzaak om eerst de vrouwtjes te bloeden voor de productie van eieren en vervolgens uit te komen en de uitgekomen eieren op te sommen om de levensvatbaarheid van het ei te bepalen.
Bovendien kan deze methode de mate van concurrentie tussen twee steriele of Wolbachia-geïnfecteerdemuggenlijnen niet onderscheiden, omdat wilde vrouwelijke muggen alleen niet-levensvatbare eieren zullen produceren bij paring met beide. Om deze beperkingen te omzeilen, beschrijft dit artikel een meer directe methode voor het meten van het concurrentievermogen van mannelijke muggen in laboratoriumomgevingen met behulp van de fluorescerende kleurstof rhodamine B (RhB), die kan worden gebruikt om mannetjes te markeren door ze te voeden in sucrose-oplossing die RhB bevat. Na de paringstest kan de aanwezigheid van fluorescerende spermacellen in de spermathecae van een vrouw worden gebruikt om haar paringspartner te bepalen. Deze methode is kosteneffectief, vermindert de experimentele tijd met 90% en maakt vergelijking van de paringsgeschiktheid tussen twee steriele of Wolbachia-geïnfecteerdelijnen mogelijk.
Het fokken en vrijgeven van steriele of incompatibele mannetjes voor onderdrukking van Aedes-muggenpopulaties wordt momenteel in het veld geëvalueerd als een nieuw hulpmiddel om uitbraken van dengue en andere door Aedesovergedragen ziekten te voorkomen1. Onderdrukkingsstrategieën voor mannelijke vrijlating die momenteel in veldproeven zijn, omvatten het gebruik van de genetische methode2, bestraling (Steriele Insect Techniek, SIT)3, endosymbiotische bacteriën Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4, of een combinatie van de laatste twee technieken5,6. Het succes van deze benaderingen is grotendeels afhankelijk van het vermogen van de vrijgelaten mannetjes om wilde mannetjes te overtreffen en vrouwtjes te zoeken om copulatie te garanderen. Anders kan steriliteit niet worden geïnduceerd in de doelpopulatie.
In een klassiek SIT-programma kan de mannelijke paringsconditie bijvoorbeeld worden beïnvloed door factoren zoals bestralingsdosis7,8,9,massaopfokprotocol en de mate van inteelt in de kolonie10,11,12,13,14. Bovendien kunnen studies over het concurrentievermogen van de paring belangrijke kennis opleveren over het paringsgedrag van muggen die kan worden gebruikt om vectorbestrijdingsstrategieën te informeren.
In SIT en IIT wordt de paringsconcurrentie van mannelijke muggen meestal beoordeeld door zowel wild-type als release-stam te laten concurreren om wild-type vrouwtjes in een kooi8,11,15,16. Vrouwtjes worden vervolgens met bloed gevoed en hun eieren uitgebroed om de levensvatbaarheid te bepalen. Vrouwtjes die niet-levensvatbare eieren of eieren met een lage broedsnelheid leggen, worden verondersteld te hebben gepaard met mannetjes van de lossingsstam, terwijl vrouwtjes die levensvatbare eieren produceren, worden verondersteld te hebben gepaard met mannetjes van het wildtype. Paring concurrentievermogen wordt vervolgens berekend met de Fried Index17. Helaas is deze methode resource-intensief en tijdrovend, en de algehele Fried Index kan worden beïnvloed door externe verstorende factoren die de levensvatbaarheid van eieren beïnvloeden, zoals slechte verwerking van eieren en overdroging, kan resulteren in een lage uitkomstsnelheid in de compatibiliteitskruising die vervolgens kan leiden tot een kunstmatig lage Fried Index.
Bovendien maakt deze methode het niet mogelijk om de paringsconcurrentie te vergelijken tussen Aedes-muggen die zijn geïnfecteerd met verschillende stammen van Wolbachia of die worden blootgesteld aan verschillende doses bestraling. Daarom is een meer directe methode nodig om deze uitdagingen aan te pakken. Recente studies18,19 hebben de effectiviteit aangetoond van het gebruik van de fluorescerende kleurstof, RhB, om de zaadvloeistof van mannelijke muggen te markeren. Gemarkeerde zaadvloeistof wordt overgebracht en opgeslagen in de spermathecae van de vrouwelijke muggen na succesvolle paring, waardoor directe meting van vrouwelijke paringsinteractie met gemarkeerde mannetjes mogelijk is. Rhodamine B is een thiol-reactieve fluorone kleurstof die vaak wordt gebruikt als biomarker voor ecologische en gedragsonderzoeksstudies bij dieren, waaronder insecten20. Voor muggenstudies wordt RhB geïntroduceerd door te voeden met suiker- of honingwater dat opgelost RhB-poederbevat 18,19,21,22,23,24. Bij opname bindt de RhB-kleurstof zich aan eiwitten en kleurt lichaamsweefsel met een roodachtig roze vlek die feloranje fluoresceert onder een fluorescerende lichtbron.
Het sterke fluorescentiesignaal en de stabiliteit van de markering, in combinatie met het vermogen om zaadvloeistoffen van insecten te kleuren, maakt het mogelijk om de overdracht van gemarkeerde zaadvloeistof van het gelabelde mannetje naar de spermaopslagorganen van het vrouwelijke insect te controleren voor paringsstudies18,19,21,24. Het gebruik van RhB in een mannelijke paringsconcurrentietest maakt niet alleen directe meting van de paringsinteractie van vrouwtjes met gemarkeerde en ongemarkeerde mannetjes mogelijk, maar de resultaten kunnen ook binnen 24 uur worden verkregen, omdat het het proces van het bepalen van de levensvatbaarheid van het ei, dat meestal ongeveer 10 tot 14 dagen vereist, overbodig maakt. Bovendien overwint deze methode het potentiële verlies van gegevens wanneer de vrouwelijke muggen zich niet voeden of sterven voordat ze zich verplaatsen. Dit is vooral cruciaal omdat in semi-veldproeven, waar vrouwelijke muggen gevoelig zijn voor schade en dood tijdens het verzamelen na de paring met behulp van een rugzak of mechanische aspirator. Om de huidige beperkingen van het gebruik van vrouwelijke vruchtbaarheid aan te pakken, presenteren we een alternatieve methode die RhB-kleuring gebruikt om het concurrentievermogen van mannelijke muggenparing direct te meten. De methode vereenvoudigt de workflow, verkort de experimentele tijd van ongeveer twee weken tot één dag, waardoor meer experimentele replicaties kunnen worden uitgevoerd en vergelijking tussen twee vrijgavestammen mogelijk is. Dit protocol zal geschikt zijn voor laboratoria die beginnen met op mannelijke vrijlating gebaseerde muggenpopulatieonderdrukkingsprogramma’s en kan worden gebruikt voor routinematige kwaliteitscontrole en stamevaluatie.
Markering wordt vaak gebruikt in entomologisch onderzoek om de dynamiek, verspreiding, gedrag en paringsbiologie van insectenpopulaties te bestuderen26. In SIT- en IIT-programma’s wordt markering uitgevoerd om de vrijgavestam te onderscheiden van de veldpopulatie om hun verspreiding te bestuderen en de afgifteverhouding te optimaliseren. De gebruikte markeringsmethoden omvatten genetische markering27,28,het opnemen van isotopen in larvaal voedsel29,30,fluorescerend stof31en kleurstof32. Voor de onderdrukking van muggenpopulaties met behulp van SIT of IIT, waarbij mannelijke paringsfitness een cruciaal onderdeel is, zijn fluorescerende kleurstoffen gebruikt als markers om de biologie van de paring van muggen te bestuderen18,19.
Conventioneel is de beoordeling van het mannelijke paringsconcurrentievermogen van de vrijgavestam beoordeeld met behulp van vrouwelijke vruchtbaarheidstests. Deze test is echter tijdrovend en arbeidsintensief vanwege downstream experimentele processen na de paring(aanvullende figuur S1). Deze processen omvatten bloedvoeding van de vrouwtjes, het verzamelen van eieren, het uitkomen van de eieren en het opsommen van het aandeel uitgekomen eieren om de levensvatbaarheid van het ei te bepalen. Gemiddeld vereist deze test 30 manuren en twee weken experimenteel werk (te beginnen met het opzetten van de concurrentievermogenstestkooien) tot de uiteindelijke bepaling van de mannelijke paringsconcurrentie.
zijn paper presenteert het gebruik van een fluorescerende kleurstof, RhB, (gevoed als 0,2% RhB-sucrose aan de muggen, aanvullende figuur S2) om paringsinteracties tussen vrouwtjes en RhB-gemarkeerde mannetjes direct te meten. Hoewel dit protocol een fluorescentie-stereomicroscoop vereist, voorkomt het de noodzaak om de hierboven genoemde tijdrovende experimentele procedures uit te voeren. Gemiddeld heeft deze op RhB gebaseerde test ongeveer 10 manuren en ongeveer een dag nodig om gegevens te verkrijgen die gelijkwaardig zijn aan die van vrouwelijke vruchtbaarheidstests. Dit > 90% tijdsbesparing stelt onderzoekers in staat om meerdere experimentele replicaties uit te voeren, wat een robuustere validatie van mannelijke paringsfitness oplevert. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de paringsconcurrentie tussen twee steriele of wolbachia-geïnfecteerde muggenlijnen te vergelijken.
Dit type vergelijking is niet mogelijk met conventionele vrouwelijke vruchtbaarheidstests, omdat vrouwtjes niet-levensvatbare eieren zouden opleveren bij paring met beide lijnen. Desondanks zal elke gemengde paring in het experiment resulteren in vertekening ten opzichte van de gemarkeerde populatie, omdat het moeilijk is om ongemarkeerde spermacellen in vrouwelijke spermathecae te identificeren die zaadvloeistof bevatten van zowel RhB-gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes. Een vergelijkbare conclusie werd getrokken in een onderzoek naar de paringsconcurrentie van Anopheles gambiae met rhB18, waarbij een groter deel van de vrouwtjes in de paringstest werd gedekt door gemarkeerde mannetjes. Omdat polyandrie vaker voorkomt bij vrouwtjes die eerder een onderbroken paring hadden uitgevoerd33, werd de kans dat dit zou gebeuren in deze studie verminderd door minder muggen (20 mannetjes tot 10 vrouwtjes) te gebruiken in een groter kooivolume (0,216 m3) in deze experimenten.
De resultaten toonden geen voorkeur voor de RhB-gemarkeerde populatie, wat aangeeft dat gemengde paring beperkt was. Samenvattend is de opname van RhB om mannetjes te markeren in een paringsconcurrentietest een economische en snelle manier om de mannelijke paringsgeschiktheid te evalueren. Deze methode maakt ook de directe vergelijking mogelijk van paringsconcurrentievermogen tussen mannetjes die zijn blootgesteld aan verschillende doses bestraling, grootgebracht in verschillende opfokregimes of die zijn geïnfecteerd met verschillende stammen van Wolbachia, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor de evaluatie van mannelijke paringsfitness voor elk op mannelijke vrijlating gebaseerd muggenpopulatieonderdrukkingsprogramma.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gefinancierd door het National Environment Agency (NEA), Singapore. We bedanken de heer Chew Ming Fai, Deputy Chief Executive Officer (Public Health), NEA, voor zijn goedkeuring om de studie te publiceren, en A / Prof Ng Lee Ching, Group Director (Environmental Health Institute Group), NEA, voor haar steun in deze studie. We bedanken ook Dr Shuzhen Sim en Dr Denise Tan voor het proeflezen van het manuscript.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |