여기서는 형광염을 마커로 사용하여 남성 Aedes aegypti의 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 여성 모기는 교화를 위해 표시되고 표시되지 않은 수컷 모두에 노출됩니다. 후 짝짓기, 그들의 정자는 그들의 짝짓기 파트너를 결정하기 위하여 형광 현미경의 밑에 검토됩니다.
멸균 또는 호환되지 않는 곤충 기술 기반 인구 억제 프로그램의 성공은 야생 형 여성을 위해 경쟁하고 대상 인구에서 멸균을 유도하는 출시 된 남성의 능력에 달려 있습니다. 따라서, 남성 짝짓기 경쟁력의 실험실 평가는 필드 릴리스 전에 방출 균주의 체력을 평가하는 데 필수적이다. 종래, 이러한 분석은 동시에 2세트의 남성(야생형 및 방출 균주)에 노출된 후 여성에 의해 생성된 실행 가능한 계란의 비율을 결정함으로써 수행된다. 그러나, 이 과정은 계란 생산을 위해 암컷을 먼저 혈액 공급하고 부화한 계란을 부화하고 예신하여 계란 생존 가능성을 결정할 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리고 힘들다.
더욱이, 이 방법은 야생형 암컷 모기가 둘 다와 짝짓기 시 실행 불가능한 계란을 생성하기 때문에 두 개의 멸균 또는 Wolbachia-감염된모기장 사이의 경쟁력의 정도를 분별할 수 없습니다. 이러한 한계를 우회하기 위해, 이 논문은 형광염, 로다민 B(RhB)를 사용하여 실험실 환경에서 남성 모기 결합 경쟁력을 측정하는 보다 직접적인 방법을 설명하며, 이는 RhB를 함유한 자당 용액으로 수컷을 공급하는 데 사용될 수 있다. 짝짓기 분석 후, 여성의 정자에 형광 정자의 존재는 그녀의 짝짓기 파트너를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 비용 효율적이며 실험 시간을 90 % 줄이며 두 개의 멸균 또는 Wolbachia-infected 라인 사이의 짝짓기 적합성을 비교할 수 있습니다.
Aedes 모기 집단의 억제를 위한 멸균 또는 호환되지 않는 남성의 사육 및 방출은 현재 뎅기열 및 기타 Aedes-borne질병1의발병을 방지하기 위한 새로운 도구로 현장에서 평가되고 있다. 현재 현장 시험 중인 남성 방출 억제 전략은 유전적 방법2,조사(멸균 곤충 기술, SIT)3,내시생물학적 박테리아 울바키아(곤충 호환 기술, IIT)4,또는 후자의 두 기술의 조합을 포함한다5,6. 이러한 접근의 성공은 주로 야생 형 남성을 능가하고 교화를 확보하기 위해 여성을 추구하는 출시 된 남성의 능력에 달려 있습니다. 그렇지 않으면, 멸균은 대상 집단에서 유도될 수 없다.
고전SIT 프로그램에서, 예를 들어, 남성 짝짓기 적합성은 조사량7,8,9,대량 사육 프로토콜 및 식민지내 근친교의정도(10,11,12,13,14)와같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한 짝짓기 경쟁력에 대한 연구는 벡터 제어 전략을 알리는 데 사용할 수있는 모기 짝짓기 행동에 대한 중요한 지식을 제공 할 수 있습니다.
SIT 및 IIT에서, 남성 모기의 짝짓기 경쟁력은 일반적으로 케이지8,11,15,16에서야생 형 여성을 위해 경쟁하는 야생 형 및 방출 균주를 허용함으로써 평가된다. 여성은 그 때 혈액을 공급하고 그들의 계란은 생존가능성을 결정하기 위하여 부화됩니다. 낮은 해치 비율로 실행 가능한 계란 또는 계란을 낳는 암컷은 방출 긴장 수컷과 짝짓기 한 것으로 가정됩니다, 실행 가능한 계란을 생성하는 암컷은 야생 형 수컷과 짝짓기 한 것으로 가정되는 동안. 짝짓기 경쟁력은 튀김 지수17로계산됩니다. 불행히도, 이 방법은 자원 집약적이고 시간이 많이 소요되며, 전체 튀김 지수는 계란 취급 불량 및 과다 건조와 같은 계란 생존가능성에 영향을 미치는 외부 혼동 요인에 의해 영향을 받을 수 있으며, 그 후 인위적으로 낮은 튀김 지수로 이어질 수 있는 호환성 크로스의 낮은 해치 속도를 초래할 수 있다.
더욱이, 이 방법은 Wolbachia의 다른 긴장에 감염되거나 조사의 다른 복용량에 드러나는 Aedes 모기 사이 짝짓기 경쟁력의 직접적인 비교를 허용하지 않습니다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해 보다 직접적인 방법이 필요합니다. 최근 연구18,19는 형광염, RhB를 사용하여 남성 모기의 정액을 표시하는 효과를 입증했습니다. 표시된 정액은 성공적인 짝짓기 시 여성 모기의 정자에 옮겨져 저장되므로 표시된 수컷과의 여성 짝짓기 상호 작용을 직접 측정할 수 있습니다. 로다민 B는 곤충을 포함한 동물의 생태 및 행동 연구를 위한 바이오마커로서 일반적으로 사용되는 티올 반응성 플루오론 염료이다20. 모기 연구를 위해, RhB는 용존 RhB 분말18,19,21,22,23,24를포함하는 설탕 또는 꿀 수를 공급하여 도입된다. 섭취시 RhB 염료는 단백질에 결합하여 형광원 아래에서 밝은 주황색을 형광하는 붉은 분홍색 얼룩으로 신체 조직을 염색합니다.
강한 형광 신호 및 마킹의 안정성, 곤충 정액을 얼룩화하는 능력과 결합, 짝짓기 연구를위한 여성 곤충의 정자 저장 기관에 표시 된 정액유체의 전송의 모니터링을 허용18,19,21,24. 남성 짝짓기 경쟁력 분석에서 RhB의 사용은 표시 및 표시가없는 남성과 여성의 짝짓기 상호 작용을 직접 측정 할 뿐만 아니라 일반적으로 약 10 ~ 14 일이 필요한 계란 생존가능성을 결정하는 과정을 없애기 때문에 24 시간 이내에 결과를 얻을 수 있습니다. 게다가, 이 방법은 여성 모기가 소변을 기전에 혈액 을 공급하거나 정지하지 않을 때 데이터의 잠재적인 손실을 극복합니다. 이것은 특히 중요한 반 필드 예심에서, 여성 모기가 배낭 또는 기계적인 흡인기를 사용하여 결합 후 수집 도중 손상과 죽음을 경향이 있기 때문에. 여성 다산을 사용하는 현재의 한계를 해결하기 위해 RhB 염색을 사용하여 남성 모기 결합 경쟁력을 직접 측정하는 대체 방법을 제시합니다. 이 방법은 워크플로우를 단순화하고 실험 시간을 약 2주에서 1일로 단축하여 더 많은 실험 복제를 수행하고 두 개의 방출 균주 간의 비교를 허용합니다. 이 프로토콜은 남성 방출 기반 모기 인구 억제 프로그램에 착수하는 실험실에 적합하며 일상적인 품질 관리 및 변형 평가에 사용될 수 있습니다.
마킹은 곤충 인구 역학, 분산, 행동 및 짝짓기생물학(26)을연구하기 위해 곤충 연구에 일반적으로 사용된다. SIT 및 IIT 프로그램에서는 방출 균주를 현장 인구와 차별화하여 분산을 연구하고 방출 비율을 최적화하기 위해 마킹이 수행됩니다. 사용되는 마킹 방법에는 유전마킹(27,28)이포함되며, 애벌레식품(29,30,형광먼지 31) 및 염료(32)에 동위원소를 통합한다. 남성 짝짓기 피트니스가 중요한 성분인 SIT 또는 IIT를 사용하여 모기 집단을 억제하기 위해 형광염료는 모기 결합 생물학18,19를연구하기 위한 마커로 사용되었습니다.
종래, 방출 균주의 남성 짝짓기 경쟁력의 평가는 여성 불임 검사를 사용하여 평가되었다. 그러나, 이 분석은 다운스트림 실험 프로세스 후결합(보충 도서 S1)으로인해 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 이 프로세스는 여성의 혈액 공급, 계란 수집, 계란의 부화, 계란 생존 가능성을 결정하기 위해 부화 계란의 비율의 열거를 포함한다. 평균적으로, 이 분석법은 30시간의 인력과 2주간의 실험적 작업(경쟁력 분석 케이지 설정부터 시작)이 남성 짝짓기 경쟁력의 최종 결정에 필요합니다.
그의 논문은 형광염, RhB의 사용을 제시, RhB, (로 공급 0.2% RhB-자당 모기에, 보충 도도 S2)여성과 RhB 표시 남성 사이의 짝짓기 상호 작용을 직접 측정하기 위해. 이 프로토콜은 형광 스테레오 현미경을 필요로하지만, 위에서 언급 한 시간이 많이 걸리는 실험 절차를 수행 할 필요성을 없애. 평균적으로, 이 RhB 기지를 둔 분석은 여성 불임 분석에서 그것과 동등한 데이터를 얻기 위하여 대략 10 명의 남자 시간 및 대략 하루가 요구합니다. 이 >90% 시간 절약 연구원 여러 실험 복제를 수행 할 수 있습니다., 남성 짝짓기 피트 니스의 더 강력한 유효성 검사를 제공. 또한, 이러한 분석은 두 개의 멸균 또는 울바키아 감염 모기 라인 사이의 짝짓기 경쟁력을 비교하는 데 사용될 수 있다.
비교의 이 모형은 전통적인 여성 불임 assays와 함께 가능하지 않습니다, 암컷은 그 같은 둘 다 선과 짝짓기때 실행 불가능한 계란을 산출할 것이기 때문에. 그럼에도 불구하고, 실험에 있는 어떤 혼합 결합든지 RhB 표시및 표시가 없는 남성 둘 다에서 정액을 포함하는 여성 spermathecae에 있는 표시되지 않은 정액을 확인하는 것은 어렵기 때문에 표시된 인구에 대한 편견귀착될 것입니다. 유사한 결론은 RhB18을사용하여 Anopheles 감비아의 짝짓기 경쟁력을 평가하는 연구에서 이루어졌으며, 이에 따라 짝짓기 분석에서 여성의 비율이 더 큰 것은 표시된 남성에 의해 결합된 것으로 나타났습니다. 폴리안드리가 이전에 중단된짝짓기(33)에종사했던 여성에서 발생할 가능성이 높기 때문에, 이러한 실험에서 더 큰 케이지 부피(0.216m3)에서더 적은 모기(20~10명의 암컷)를 사용하여 이 연구에서 발생할 확률이 감소하였다.
결과는 혼합 짝짓기가 제한되었다는 것을 나타내는 RhB 표시 인구에 대한 편견을 보여주지 않았습니다. 요약하자면, 짝짓기 경쟁력 분석에서 남성을 표시하는 RhB의 통합은 남성 짝짓기 체력을 평가하는 경제적이고 빠른 방법입니다. 이 방법은 또한 다른 조사 복용량에 노출된 남성, 다른 양육 정권에서 자란 남성, 또는 Wolbachia의다른 균주에 감염된 남성 간의 짝짓기 경쟁력을 직접 비교할 수 있게 하여 남성 방출 기반 모기 인구 억제 프로그램에 대한 남성 짝짓기 적합성 평가를 위한 귀중한 도구입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 싱가포르 국립 환경청(NEA)의 지원을 받았습니다. 우리는 이 연구 결과에 있는 그녀의 지원을 위해, 연구 결과를 출판하는 그의 승인에, 씨 츄 밍 파이, 부최고 경영자 (공중 위생), NEA, 연구 결과를 출판하는 그의 승인에 감사드립니다, A/교수 Ng Lee Ching, 그룹 이사 (환경 보건 연구소 그룹), NEA, 이 연구 결과에 있는 그녀의 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 슈젠 심 박사와 데니스 탄 박사에게 원고를 교정해 주신 것에 감사드립니다.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |