Retinal organoid induktionssystem til afledning af 3D Retinal-væv fra humane pluripotente stamceller

Summary

Her beskriver vi et optimeret retinal organoid induktionssystem, som er velegnet til forskellige menneskelige pluripotente stamcellelinjer til at generere retinale væv med høj reproducerbarhed og effektivitet.

Abstract

Retinal degenerative sygdomme er hovedårsagerne til irreversibel blindhed uden effektiv behandling. Pluripotente stamceller, der har potentiale til at differentiere sig til alle typer af retinale celler, selv mini-retinal væv, holde store løfter for patienter med disse sygdomme og mange muligheder i sygdom modellering og lægemiddelscreening. Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er imidlertid kompliceret og tidskrævende. Her beskriver vi en optimeret retinal induktionsprotokol til generering af retinale væv med høj reproducerbarhed og effektivitet, der passer til forskellige menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokol udføres uden tilsætning af retinosyre, hvilket gavner berigelsen af kegle fotoreceptorer. Fordelen ved denne protokol er kvantificeringen af EB størrelse og plating tæthed til væsentligt at øge effektiviteten og repeterbarheden af retinal induktion. Med denne metode, alle større retinale celler sekventielt vises og rekapitulere de vigtigste trin i retinal udvikling. Det vil lette downstream applikationer, såsom sygdom modellering og celleterapi.

Introduction

Retinal degenerative sygdomme (RDs), såsom aldersrelaterede makuladegeneration (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er karakteriseret ved dysfunktion og død fotoreceptor celler og typisk føre til irreversibel synstab uden effektive måder at helbrede¹. Mekanismen bag disse sygdomme er stort set ukendt delvist på grund af mangel på menneskelige sygdomsmodeller². I løbet af de sidste årtier er der sket betydelige fremskridt inden for regenerativ medicin gennem stamcelleteknologi. Mange forskere, herunder os selv, har vist, at humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder menneskelige embryonale stamceller (hESC’ er) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC’er), kan differentiere sig til alle typer retinale celler, selv mini-retinale væv gennem forskellige differentieringsmetoder^{3,4,5,6,7,8,9,10, 11}, giver enorme potentiale i sygdom modellering og celleterapi^12,13,14.

Induktionsprocessen fra hPSCs til retinale celler er imidlertid meget kompliceret og tidskrævende med lav repeterbarhed, hvilket kræver forskere med rig erfaring og høje færdigheder. Under den komplekse og dynamiske induktionsproces vil en række faktorer påvirke udbyttet af retinal væv^15,16,17. Forskellige induktionsmetoder varierer også ofte betydeligt i timing og robust udtryk for retinale markører, hvilket kan forvirre prøveindsamlingen og datafortolkningen³. Derfor ville en enkel protokol med retinal differentiering fra hPSC’er med trinvis vejledning være efterspurgt.

Her, baseret på vores offentliggjorte undersøgelser^18,19,20,21, en optimeret retinal induktion protokol til at generere retinale organoider (ROs) med rige kegle fotoreceptorer fra hPSCs er beskrevet, som ikke kræver tilskud af retinosyre (RA). Denne protokol fokuserer på beskrivelsen af multi-trins metode til at generere neural nethinden og RPE. EB-dannelse er den væsentlige del af den tidlige induktionsfase. Både størrelse og plating tæthed af EBs er kvantitativt optimeret, hvilket videnskabeligt forbedrer udbyttet af retinale væv og fremmer repeterbarhed. I anden del af induktionen organiserer optiske vesikler (OVs) sig selv i klæbekulturen og ROs form i suspensionskulturen; tidskurserne og effektiviteten af denne del varierer betydeligt i forskellige hPSC-linjer. Modningen og specifikationen af retinale celler i ROs forekommer hovedsageligt i den midterste og sene fase af induktion. Uden tilsætning af RA kan modne fotoreceptorer med både rige kegler og stænger produceres.

Formålet med denne protokol er kvantitativt at beskrive og detaljer hvert trin for uerfarne forskere at gentage. Forskellige hPSC linjer er blevet med succes induceret i ROs af denne protokol med et robust udbytte af kegle-rige retinale væv og høj repeterbarhed. HPSCs-afledte ROs med denne protokol kan generobre de vigtigste trin i retinal udvikling in vivo, og overleve langsigtede, hvilket letter downstream applikationer, såsom sygdom modellering, lægemiddelscreening, og celleterapi.

Protocol

1. Kultur og udvidelse af hPSC’er HPSC-kultur Coat to brønde af en 6-brønds plade med ekstracellulær matrix (ECM, hESC-kvalificeret matrix). Klargør 50 mL af en ECM-opløsning, der indeholder 8-12 μg/mL ECM i Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM). I 49 mL DMEM tilsættes 1 mL af den optøede ECM-lageropløsning (50x). Tilsættes 1 mL af ECM-opløsningen til hver brønd af en 6-brønds plade. Inkuberes i 1 time i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Forbere…

Representative Results

Den retinale induktion proces i denne protokol efterligner udviklingen af menneskelige foster nethinden. For at indlede nethindedifferentiering blev hPSC’er adskilt i små klumper og kultiveret i suspension for at fremkalde dannelsen af EBs. På D1 dannes de uniformerede celleaggregater eller EBs (figur 1C). Kulturmediet blev gradvist skiftet til NIM. På D5 blev EBs forgyldt på de ECM-coatede kulturretter. Cellerne migrerede gradvist ud af EB’erne (figur 1D). …

Discussion

I denne multi-trins retinale induktion protokol, hPSCs blev guidet trin for trin for at få retinal skæbne, og selvorganiseret i retinale organoider, der indeholder lamineret NR og RPE. Under differentiering, hPSCs rekapituleret alle større trin i den menneskelige retinale udvikling in vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper af retinale celler, herunder retinale ganglion celler, amakrine celler, bipolare celler, stang, og kegle fotoreceptorer, og muller glial celler i en ruml…

Materials

(−)-Blebbistatin	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inhibitor
1 ml tips	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml pipette	Sorfa	3141001	Pipette
100 mm Tissue culture	BIOFIL	TCD000100	100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture	Falcon	353003	100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150	Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes	Falcon	353001	35 mm Petri dish
5 ml pipette	Sorfa	313000	Pipette
50 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500	Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates	Costar	3516	Culture plates
Anti-AP2α Antibody	DSHB	3b5	Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X	Gibco	15240062	Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody	Boster	BM4446	Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody	Abcam	ab15580	Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody	gift from Dr. jeremy	/	Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody	DSHB	pax6	Primary antibody
Anti-rabbit 555	Invitrogen	A31572	Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody	Millipore	ab5585	Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody	Abcam	ab5417	Primary antibody
Anti-sheep 555	Invitrogen	A21436	Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody	Abclonal	A19710	Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody	Millipore	ab9016	Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Supplement
Cryotube vial	Thermo scientific-NUNC	375418	1.8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Multiple suppliers
DMEM	Gibco	C11995500BT	Medium
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Medium
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE	Serum
Filter	Millipore	SLGP033RB	0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine
Heparin	Sigma	H3149	2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement	Gibco	17502048	Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer	GNM	GNM10010	Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine	Sigma	T0625	Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment	Corning	CLS3262-20EA	Petri dish