Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

Abstract

Le malattie degenerative della retina sono le principali cause di cecità irreversibile senza un trattamento efficace. Le cellule staminali pluripotenti che hanno il potenziale per differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche, anche nei tessuti mini-retinici, hanno enormi promesse per i pazienti con queste malattie e molte opportunità nella modellazione delle malattie e nello screening farmacologico. Tuttavia, il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è complicato e richiede molto tempo. Qui, descriviamo un protocollo di induzione retinica ottimizzato per generare tessuti retinici ad alta riproducibilità ed efficienza, adatti a varie cellule staminali pluripotenti umane. Questo protocollo viene eseguito senza l’aggiunta di acido retinoico, che avvantaggia l’arricchimento dei fotorecettori del cono. Il vantaggio di questo protocollo è la quantificazione della dimensione EB e della densità di placcatura per migliorare significativamente l’efficienza e la ripetibilità dell’induzione retinica. Con questo metodo, tutte le principali cellule retiniche appaiono sequenzialmente e ricapitolano le fasi principali dello sviluppo retinico. Faciliterà le applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie e la terapia cellulare.

Introduction

Le malattie degenerative della retina (NDI), come la degenerazione maculare legata all’età (AMD) e la retinite pigmentosa (RP), sono caratterizzate dalla disfunzione e dalla morte delle cellule fotorecettrici e in genere portano a una perdita irreversibile della vista senza modi efficaci per curare¹. Il meccanismo alla base di queste malattie è in gran parte sconosciuto in parte a causa della mancanza di modelli di malattie umane². Negli ultimi decenni, sono stati compiuti progressi significativi nella medicina rigenerativa attraverso la tecnologia delle cellule staminali. Molti ricercatori, noi compresi, hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), possono differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche, anche mini-tessuti retinici attraverso vari approcci di differenziazione^{3,4,5,6,7,8,9,10, 11}, fornendo un enorme potenziale nella modellazione delle malattie e nella terapia cellulare^12,13,14.

Tuttavia, il processo di induzione dalle hPSC alle cellule retiniche è altamente complicato e richiede tempo con bassa ripetibilità, che richiede ricercatori con una ricca esperienza e competenze elevate. Durante il complesso e dinamico processo di induzione, una serie di fattori influenzerà la resa dei tessuti retinici^15,16,17. Inoltre, diversi metodi di induzione spesso variano considerevolmente nei tempi e nell’espressione robusta dei marcatori retinici, il che potrebbe confondere la raccolta del campione e l’interpretazione dei dati³. Pertanto, sarebbe richiesto un protocollo semplice di differenziazione retinica dalle hPSC con una guida passo-passo.

Qui, sulla base dei nostri studi pubblicati^18,19,20,21,viene descritto un protocollo di induzione retinica ottimizzato per generare organoidi retinici (RO) con ricchi fotorecettori a cono da hPSC, che non richiede l’integrazione di acido retinoico (RA). Questo protocollo si concentra sulla descrizione del metodo multi-step per generare retina neurale e RPE. La formazione di EB è la parte essenziale della fase iniziale di induzione. Sia le dimensioni che la densità di placcatura degli EB sono ottimizzate quantitativamente, il che migliora scientificamente la resa dei tessuti retinici e promuove la ripetibilità. Nella seconda parte dell’induzione, le vescicole ottiche (OV) si auto-organizzano nella cultura dell’aderenza e le RO si formano nella cultura della sospensione; i corsi di tempo e le efficienze di questa parte variano considerevolmente nelle diverse linee hPSC. La maturazione e la specificazione delle cellule retiniche nei RIO si verificano principalmente nella fase intermedia e tardiva dell’induzione. Senza l’aggiunta di RA, è possibile produrre fotorecettori maturi con coni e aste ricchi.

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere quantitativamente e dettagliare ogni passaggio per i ricercatori inesperti da ripetere. Varie linee hPSC sono state indotte con successo in RO da questo protocollo con una robusta resa di tessuti retinici ricchi di coni e un’elevata ripetibilità. Le RO derivate da HPSC con questo protocollo possono ricapitolare le fasi principali dello sviluppo retinico in vivoe sopravvivere a lungo termine, il che facilita le applicazioni a valle, come la modellazione delle malattie, lo screening farmacologico e la terapia cellulare.

Protocol

1. Cultura ed espansione delle hPSC Cultura HPSC Rivestire due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con matrice extracellulare (ECM, matrice qualificata hESC). Preparare 50 mL di una soluzione ECM contenente 8-12 μg/mL di ECM nel Modified Eagle’s Medium (DMEM) di Dulbecco. In 49 mL di DMEM, aggiungere 1 mL della soluzione stock ECM scongelata (50x). Aggiungere 1 mL di soluzione ECM a ciascun pozzettino di una piastra a 6 pozzetti. Incubarlo per 1 ora in un incubatore a 37 °C e 5% CO…

Representative Results

Il processo di induzione retinica in questo protocollo imita lo sviluppo della retina fetale umana. Per avviare la differenziazione retinica, le hPSC sono state dissociate in piccoli grumi e coltivate in sospensione per indurre la formazione di EB. Su D1, si sono formati aggregati di celle uniformate o EB (Figura 1C). Il mezzo di coltura è stato gradualmente trasferito in NIM. Su D5, gli EB sono stati placcati sui piatti di coltura rivestiti in ECM. Le celle migrarono gradualmente fuori dag…

Discussion

In questo protocollo di induzione retinica in più fasi, le hPSC sono state guidate passo dopo passo per ottenere il destino retinico e auto-organizzate in organoidi retinici contenenti NR e RPE laminati. Durante la differenziazione, le hPSC hanno ricapitolato tutte le principali fasi dello sviluppo della retina umana in vivo,da EF, OV e RPE, alla laminazione retinica, generando tutti i sottotipi di cellule retiniche, comprese le cellule gangliari retiniche, le cellule amacrine, le cellule bipolari, i fotorecett…

Materials

(−)-Blebbistatin	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inhibitor
1 ml tips	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml pipette	Sorfa	3141001	Pipette
100 mm Tissue culture	BIOFIL	TCD000100	100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture	Falcon	353003	100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150	Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes	Falcon	353001	35 mm Petri dish
5 ml pipette	Sorfa	313000	Pipette
50 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500	Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates	Costar	3516	Culture plates
Anti-AP2α Antibody	DSHB	3b5	Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X	Gibco	15240062	Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody	Boster	BM4446	Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody	Abcam	ab15580	Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody	gift from Dr. jeremy	/	Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody	DSHB	pax6	Primary antibody
Anti-rabbit 555	Invitrogen	A31572	Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody	Millipore	ab5585	Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody	Abcam	ab5417	Primary antibody
Anti-sheep 555	Invitrogen	A21436	Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody	Abclonal	A19710	Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody	Millipore	ab9016	Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Supplement
Cryotube vial	Thermo scientific-NUNC	375418	1.8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Multiple suppliers
DMEM	Gibco	C11995500BT	Medium
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Medium
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE	Serum
Filter	Millipore	SLGP033RB	0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine
Heparin	Sigma	H3149	2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement	Gibco	17502048	Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer	GNM	GNM10010	Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine	Sigma	T0625	Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment	Corning	CLS3262-20EA	Petri dish