Retinal organoid induksjonssystem for avledning av 3D retinal vev fra humane pluripotente stamceller

Summary

Her beskriver vi et optimalisert retinal organoid induksjonssystem, som er egnet for ulike menneskelige pluripotente stamcellelinjer for å generere netthinnevev med høy reproduserbarhet og effektivitet.

Abstract

Retinal degenerative sykdommer er hovedårsakene til irreversibel blindhet uten effektiv behandling. Pluripotente stamceller som har potensial til å skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-retinal vev, holder store løfter for pasienter med disse sykdommene og mange muligheter innen sykdomsmodellering og legemiddelscreening. Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid komplisert og tidkrevende. Her beskriver vi en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal vev med høy reproduserbarhet og effektivitet, egnet for ulike menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokollen utføres uten tilsetning av retinoinsyre, noe som fordeler berikelsen av kegle fotoreseptorer. Fordelen med denne protokollen er kvantifisering av EB-størrelse og platingtetthet for å forbedre effektiviteten og repeterbarheten av retinal induksjon betydelig. Med denne metoden vises alle store retinale celler sekvensielt og rekapitulerer hovedtrinnene i retinal utvikling. Det vil lette nedstrømsapplikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering og celleterapi.

Introduction

Retinal degenerative sykdommer (RDs), som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er preget av dysfunksjon og død av fotoreseptorceller og fører vanligvis til irreversibel synstap uten effektive måter å kurere¹. Mekanismen som ligger til grunn for disse sykdommene er i stor grad ukjent delvis på grunn av mangel på menneskelige sykdomsmodeller². I løpet av de siste tiårene har det blitt oppnådd betydelige fremskritt innen regenerativ medisin gjennom stamcelleteknologi. Mange forskere, inkludert oss selv, har vist at humane pluripotente stamceller (hPSCer), inkludert humane embryonale stamceller (hESCer) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer), kan skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-netthinnevev gjennom ulike differensieringsmetoder^{3,4,5,6,7,8,9,10, 11}, gir stort potensial i sykdomsmodellering og celleterapi^12,13,14.

Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid svært komplisert og tidkrevende med lav repeterbarhet, noe som krever forskere med rik erfaring og høye ferdigheter. Under den komplekse og dynamiske induksjonsprosessen vil en rekke faktorer påvirke utbyttet av netthinnevev^15,16,17. Også ulike induksjonsmetoder varierer ofte betydelig i timing og robust uttrykk for netthinnemarkører, noe som kan forvirre utvalgsinnsamlingen og datatolkningen³. Derfor vil en enkel protokoll for retinal differensiering fra hPSCer med trinnvis veiledning være etterspurt.

Her, basert på våre publiserte studier^18,19,20,21, beskrives en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal organoider (ROer) med rike kjeglefotoreseptorer fra hPSCer, noe som ikke krever tilskudd av retinoinsyre (RA). Denne protokollen fokuserer på beskrivelsen av flertrinnsmetoden for å generere nevral netthinne og RPE. EB-dannelse er den essensielle delen av det tidlige induksjonsstadiet. Både størrelse og plating tetthet av EBs er kvantitativt optimalisert, noe som vitenskapelig forbedrer utbyttet av retinal vev og fremmer repeterbarhet. I den andre delen av induksjonen organiserer optiske vesikler (OVs) seg selv i overholdelseskulturen og ROene i suspensjonskulturen; Tidskursene og effektiviteten til denne delen varierer betydelig i forskjellige hPSC-linjer. Modning og spesifikasjon av retinalceller i ROer forekommer hovedsakelig i midten og sen fase av induksjon. Uten tilsetning av RA kan modne fotoreseptorer med både rike kjegler og stenger produseres.

Formålet med denne protokollen er å kvantitativt beskrive og detaljere hvert trinn for uerfarne forskere å gjenta. Ulike hPSC linjer har blitt vellykket indusert i ROs av denne protokollen med et robust utbytte av kjeglerik retinal vev og høy repeterbarhet. HPSCs-avledede ROer med denne protokollen kan rekapitulere hovedtrinnene for retinal utvikling i vivo, og overleve langsiktige, noe som letter nedstrøms applikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celleterapi.

Protocol

1. Kultur og utvidelse av hPSCer HPSC-kultur Belegge to brønner av en 6-brønns plate med ekstracellulær matrise (ECM, hESC-kvalifisert matrise). Forbered 50 ml ECM-oppløsning som inneholder 8-12 μg/ml ECM i Dulbeccos modifiserte ørns medium (DMEM). I 49 ml DMEM tilsettes 1 ml av den opptinte ECM-lagerløsningen (50x). Tilsett 1 ml ECM-oppløsning i hver brønn på en 6-brønns plate. Inkuber den i 1 time i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Klargjør hPSC …

Representative Results

Den retinal induksjonsprosessen i denne protokollen etterligner utviklingen av menneskelig foster netthinne. For å initiere retinal differensiering ble hPSC-er dissosiert i små klumper og dyrket i suspensjon for å indusere dannelsen av EBs. På D1 ble de uniformerte cellemengdene eller EB-ene dannet (Figur 1C). Kulturmediet ble gradvis omdannet til NIM. På D5 ble EBs belagt på ECM-belagte kulturretter. Celler migrerte gradvis ut av EB-ene (figur 1D). Fra D1…

Discussion

I denne flertrinns retinal induksjonsprotokollen ble hPSC-er veiledet trinn for trinn for å få retinal skjebne, og selvorganisert i retinal organoider som inneholder laminert NR og RPE. Under differensiering, hPSC recapitulated alle viktige trinn i menneskelig retinal utvikling i vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper av retinal celler, inkludert retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolare celler, stang, og kjegle fotoreseptorer, og muller glial celler i en romlig og …

Materials

(−)-Blebbistatin	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inhibitor
1 ml tips	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml pipette	Sorfa	3141001	Pipette
100 mm Tissue culture	BIOFIL	TCD000100	100 mm Petri dish
100 mm Tissue culture	Falcon	353003	100 mm Petri dish
15 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150	Centrifuge tubes
35 mm Tissue culture dishes	Falcon	353001	35 mm Petri dish
5 ml pipette	Sorfa	313000	Pipette
50 ml Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500	Centrifuge tubes
6 wells tissue culture plates	Costar	3516	Culture plates
Anti-AP2α Antibody	DSHB	3b5	Primary antibody
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X	Gibco	15240062	Antibiotic-Antimycotic
Anti-ISL1 Antibody	Boster	BM4446	Primary antibody
Anti-Ki67 Antibody	Abcam	ab15580	Primary antibody
Anti-L/M opsin Antibody	gift from Dr. jeremy	/	Primary antibody
Anti-PAX6 Antibody	DSHB	pax6	Primary antibody
Anti-rabbit 555	Invitrogen	A31572	Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverin Antibody	Millipore	ab5585	Primary antibody
Anti-Rhodopsin Antibody	Abcam	ab5417	Primary antibody
Anti-sheep 555	Invitrogen	A21436	Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Antibody	Abclonal	A19710	Primary antibody
Anti-VSX2 Antibody	Millipore	ab9016	Primary antibody
B-27 supplement W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Supplement
Cryotube vial	Thermo scientific-NUNC	375418	1.8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Multiple suppliers
DMEM	Gibco	C11995500BT	Medium
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Medium
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE	Serum
Filter	Millipore	SLGP033RB	0.22μm, sterile Millex filter
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanyl-L-glutamine
Heparin	Sigma	H3149	2 mg/ml in PBS to use
Matrigel, 100x	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	hPSCs maintenance medium (MM)
N2 supplement	Gibco	17502048	Supplement
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer	GNM	GNM10010	Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M
Taurine	Sigma	T0625	Supplement
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment	Corning	CLS3262-20EA	Petri dish