Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Resumo

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Resumo

Doenças degenerativas da retina são as principais causas de cegueira irreversível sem tratamento efetivo. Células-tronco pluripotentes que têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo mini-tecidos da retina, possuem enormes promessas para pacientes com essas doenças e muitas oportunidades na modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é complicado e demorado. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado de indução da retina para gerar tecidos de retina com alta reprodutibilidade e eficiência, adequados para várias células-tronco pluripotentes humanas. Este protocolo é realizado sem a adição de ácido retinóico, que beneficia o enriquecimento de fotorreceptores de cone. A vantagem deste protocolo é a quantificação do tamanho do EB e da densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina. Com este método, todas as principais células da retina aparecem sequencialmente e recapitulam os principais passos do desenvolvimento da retina. Facilitará aplicações a jusante, como modelagem de doenças e terapia celular.

Introdução

As doenças degenerativas da retina (RD), como a degeneração macular relacionada à idade (ED) e a retinite pigmentosa (RP), são caracterizadas pela disfunção e morte de células fotorreceptoras e normalmente levam à perda irreversível da visão sem formas efetivas de cura¹. O mecanismo subjacente a essas doenças é parcialmente desconhecido devido à falta de modelos de doenças humanas². Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram realizados na medicina regenerativa através da tecnologia de células-tronco. Muitos pesquisadores, incluindo nós mesmos, mostraram que células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), in....

Protocolo

1. Cultura e expansão de hPSCs

1. Cultura HPSC
   1. Cubra dois poços de uma placa de 6 poços com matriz extracelular (ECM, matriz qualificada pelo HESC). Prepare 50 mL de uma solução ECM contendo 8-12 μg/mL de ECM no Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco. Em 49 mL de DMEM, adicione 1 mL da solução de estoque ECM descongelada (50x). Adicione 1 mL da solução ECM a cada poço de uma placa de 6 poços. Incuba-lo por 1h em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Prepare o meio de manutenção hPSC (MM) de acordo com a instrução do fabricante.
   3. MM pré-quente em temperatura ambiente (RT) por 30 min.
   4. Descon....

Resultados

O processo de indução da retina neste protocolo imita o desenvolvimento da retina fetal humana. Para iniciar a diferenciação da retina, os HPSCs foram dissociados em pequenos aglomerados e cultivados em suspensão para induzir a formação de EBs. Em D1, formaram-se os agregados de células uniformizadas ou EBs(Figura 1C). O meio de cultura foi gradualmente transformado em NIM. Na D5, os EBs foram banhados nos pratos de cultura revestidos de ECM. As células migraram gradualmente para fora dos EB.......

Discussão

Neste protocolo de indução de retina de várias etapas, os HPSCs foram guiados passo a passo para ganhar o destino da retina, e auto-organizados em organoides de retina contendo NR e RPE laminados. Durante a diferenciação, os HPSCs recapitularam todos os principais passos do desenvolvimento da retina humana in vivo, desde EF, OV e RPE, até laminação da retina, gerando todos os subtipos de células da retina, incluindo células de gânglios da retina, células amacrinas, células bipolares, rod e fotorreceptores de con.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(&menos;)-Blebistatina	Sigma	B0560-5mg	ROCK-inibidor 1
ml pontas	Kirgen	KG1313	1 ml
10 ml pipeta	Sorfa	3141001	Pipeta
100 mm Cultura de tecidos	BIOFIL	TCD000100	100 mm Placa de Petri
100 mm Cultura de tecidos	Falcon	353003	100 mm Placa de Petri
de 15 ml Tubos de centrífuga	BIOFIL	CFT011150	Tubos de centrífuga
35 mm Placas de cultura de tecidos	Falcon	353001	35 mm Placa de Petri
Pipeta de 5 ml	Sorfa	313000	Pipeta
50 ml Tubos de centrífuga	BIOFIL	CFT011500	Tubos de centrífuga
6 poços Placas de cultura de tecidos	Costar	3516	Placas
de cultura Anti-AP2α Anticorpo	DSHB	3b5	Primário  anticorpo
ANTIBIÓTICO ANTIMICÓTICO 100X	Gibco	15240062	Antibiótico-Antimicótico
Anti-ISL1 Anticorpo	Boster	BM4446	Primário  anticorpo
Anti-Ki67 Anticorpo	Abcam	ab15580	Primário  anticorpo
Anti-L/M opsina Anticorpo	presente do Dr. jeremy	/	Primary  anticorpo
Anti-PAX6 Anticorpo	DSHB	pax6	Primário  anticorpo
Anti-coelho 555	Invitrogen	A31572	Burro anti-Coelho IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Alexa Fluor 555
Anti-Recoverina Anticorpo	Millipore	ab5585	Primário  anticorpo
Anti-Rodopsina Anticorpo	Abcam	ab5417	Primário  anticorpo
Anti-ovelha 555	Invitrogen	A21436	Burro anti-Ovelha IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Alexa Fluor 555
Anti-SOX9 Anticorpo	Abclonal	A19710	Primário  anticorpo
Anti-VSX2 Anticorpo	Millipore	ab9016	Primário  suplemento de anticorpo
B-27 W/O VIT A (50X)	Gibco	12587010	Suplemento
Frasco de tubo criogênico	Thermo scientific-NUNC	375418	1,8 ml
DAPI	DOJINDO	D532	4',6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato; vários fornecedores
Sulfóxido de dimetila (DMSO) Hybri-max	Sigma	D2650-100ML	Vários fornecedores
DMEM	Gibco	C11995500BT	Médio
DMEM /F12	Gibco	C11330500BT	Médio
EDTA	Invitrogen	15575-020	0.5 M PH 8.0
FBS	NATOCOR	SFBE	Filtro de
	Soro Millipore	SLGP033RB	0.22μ m, filtro Millex estéril
GlutaMax, 100X	Gibco	35050061	L-alanil-L-glutamina
Heparina	Sigma	H3149	2 mg/ml em PBS para usar
Matrigel, 100x	Corning	354277	Matriz extracelular (ECM)
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)	Gibco	11140050	MEM NEAA
mTeSR1	STEM CELL	85850	Suplemento de meio de manutenção de hPSCs (MM)
N2	Suplemento Gibco	17502048
Tampão de solução salina tamponada com fosfato (PBS)	GNM	GNM10010	sem Ca+,Mg+,PH7.2± 0.1 0.1M
Taurina	Sigma	T0625	Suplemento
Ultra-baixo acessório placas de cultura 100mm placa de Petri, placa	Petri	Corning	CLS3262-20EA

de de de baixo anexo