Индукционная система органоидов сетчатки для получения 3D-тканей сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека
Summary
Здесь мы описываем оптимизированную систему индукции органоидов сетчатки, которая подходит для различных линий плюрипотентных стволовых клеток человека для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью.
Abstract
Дегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами необратимой слепоты без эффективного лечения. Плюрипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки, имеют огромные перспективы для пациентов с этими заболеваниями и многие возможности в моделировании заболеваний и скрининге лекарств. Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки сложен и занимает много времени. Здесь мы описываем оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации тканей сетчатки с высокой воспроизводимостью и эффективностью, подходящих для различных плюрипотентных стволовых клеток человека. Этот протокол выполняется без добавления ретиноевой кислоты, которая способствует обогащению колбоковых фоторецепторов. Преимуществом этого протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки. При этом методе все основные клетки сетчатки последовательно появляются и повторяют основные этапы развития сетчатки. Это облегчит последующие приложения, такие как моделирование заболеваний и клеточная терапия.
Introduction
Дегенеративные заболевания сетчатки (РД), такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и пигментный ретинит (РП), характеризуются дисфункцией и гибелью фоторецепторных клеток и обычно приводят к необратимой потере зрения без эффективных способовлечения 1. Механизм, лежащий в основе этих заболеваний, в значительной степени неизвестен частично из-за отсутствия моделей заболеваний человека2. За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в регенеративной медицине с помощью технологии стволовых клеток. Многие исследователи, включая нас самих, показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs), включая эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), могут дифференцироваться во все типы клеток сетчатки, даже мини-ткани сетчатки с помощью различных подходов дифференцировки3,4,5,6,7,8,9,10, 11, обеспечивая огромный потенциал в моделировании заболеваний и клеточной терапии12,13,14.
Однако процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки очень сложен и трудоемкий с низкой повторяемостью, что требует исследователей с богатым опытом и высокой квалификацией. В ходе сложного и динамического процесса индукции на выход тканей сетчатки будет влиять ряд факторов15,16,17. Кроме того, различные методы индукции часто значительно различаются по срокам и надежной экспрессии маркеров сетчатки, что может сбить с толку сбор образцов и интерпретацию данных3. Поэтому будет востребован простой протокол дифференциации сетчатки от гПСК с пошаговым руководством.
Здесь на основе наших опубликованных исследований18,19,20,21описан оптимизированный протокол индукции сетчатки для генерации органоидов сетчатки (РО) с богатыми конусными фоторецепторами из гПСК, который не требует добавки ретиноевой кислоты (РА). Этот протокол фокусируется на описании многоступенчатого метода генерации нейронной сетчатки и RPE. Образование ЭБ является неотъемлемой частью ранней индукционной стадии. Как размер, так и плотность покрытия ЭБ количественно оптимизированы, что научно повышает выход тканей сетчатки и способствует повторяемости. Во второй части индукции зрительные везикулы (ОВ) самоорганизуются в культуре адгезии и образуютСЯ РО в культуре суспензии; временные курсы и эффективность этой части значительно варьируются в разных линиях hPSC. Созревание и спецификация клеток сетчатки в РО в основном происходят на средней и поздней стадии индукции. Без добавления РА могут быть получены зрелые фоторецепторы как с богатыми колбочками, так и с палочками.
Цель этого протокола состоит в том, чтобы количественно описать и детализировать каждый шаг для неопытных исследователей. Различные линии hPSC были успешно индуцированы в РО этим протоколом с надежным выходом богатых конусами тканей сетчатки и высокой повторяемостью. РО, полученные из ГПСК с этим протоколом, могут резюмировать основные этапы развития сетчатки in vivoи выживать в долгосрочной перспективе, что облегчает последующие приложения, такие как моделирование заболеваний, скрининг лекарств и клеточная терапия.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом многоступенчатом протоколе индукции сетчатки hPSCs руководствовались шаг за шагом, чтобы получить судьбу сетчатки, и самоорганизовывались в органоиды сетчатки, содержащие ламинированные NR и RPE. Во время дифференцировки hPSCs рекапитулировали все основные этапы развития сетчатки че…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Фондом научно-технического проекта Гуанчжоу (201803010078), Научно-техническим проектом провинции Гуандун (2017B020230003), Фондом естественных наук (NSF) Китая (81570874, 81970842), программой талантов Сотни Университета Сунь Ятсена (PT1001010) и Фондами фундаментальных исследований Государственной ключевой лаборатории офтальмологии.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
Referências
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber’s congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
