Retinal organoid induktionssystem för härledning av 3D retinal vävnader från mänskliga pluripotenta stamceller
Summary
Här beskriver vi ett optimerat retinal organoid induktionssystem, som är lämpligt för olika mänskliga pluripotenta stamcellslinjer för att generera retinal vävnader med hög reproducerbarhet och effektivitet.
Abstract
Retinal degenerativa sjukdomar är de främsta orsakerna till irreversibel blindhet utan effektiv behandling. Pluripotenta stamceller som har potential att differentiera sig i alla typer av näthinneceller, även mini-retinal vävnader, håller enorma löften för patienter med dessa sjukdomar och många möjligheter i sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är dock komplicerad och tidskrävande. Här beskriver vi ett optimerat retinal induktionsprotokoll för att generera retinal vävnader med hög reproducerbarhet och effektivitet, lämplig för olika mänskliga pluripotenta stamceller. Detta protokoll utförs utan tillsats av retinsyra, vilket gynnar anrikning av konfotoreceptorer. Fördelen med detta protokoll är kvantifieringen av EB:s storlek och pläteringstäthet för att avsevärt öka effektiviteten och repeterbarheten hos näthinneinduktion. Med denna metod visas alla större näthinneceller sekventiellt och rekapitulera de viktigaste stegen för näthinneutveckling. Det kommer att underlätta nedströmsapplikationer, såsom sjukdomsmodellering och cellterapi.
Introduction
Retinala degenerativa sjukdomar (RDs), såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och retinitis pigmentosa (RP), kännetecknas av dysfunktion och död av fotoreceptorceller och leder vanligtvis till irreversibel synförlust utan effektiva sätt att bota1. Mekanismen bakom dessa sjukdomar är till stor del okänd delvis på grund av brist på mänskliga sjukdomar modeller2. Under de senaste decennierna har betydande framsteg gjorts inom regenerativ medicin genom stamcellsteknik. Många forskare, inklusive oss själva, har visat att mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), kan differentiera i alla typer av näthinneceller, även mini-retinal vävnader genom olika differentieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, vilket ger stor potential i sjukdomsmodellering och cellterapi12,13,14.
Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är dock mycket komplicerad och tidskrävande med låg repeterbarhet, vilket kräver forskare med rik erfarenhet och hög kompetens. Under den komplexa och dynamiska induktionsprocessen kommer ett antal faktorer att påverka utbytet av näthinnevävnader15,16,17. Dessutom varierar olika induktionsmetoder ofta avsevärt i timing och robust uttryck för näthinnemarkörer, vilket kan förvirra provinsamlingen och datatolkningen3. Därför skulle ett enkelt protokoll om näthinnediimering från hPSCs med steg-för-steg-vägledning vara efterfrågat.
Här, baserat på våra publicerade studier18,19,20,21, beskrivs ett optimerat retinalinduktionsprotokoll för att generera retinalorganoider (ROs) med rika konfotoreceptorer från hPSCs, vilket inte kräver tillägg av retinsyra (RA). Detta protokoll fokuserar på beskrivningen av metoden i flera steg för att generera neural näthinna och RPE. EB-bildandet är den viktigaste delen av det tidiga induktionsstadiet. Både storleken och pläteringstätheten för EBs är kvantitativt optimerade, vilket vetenskapligt förbättrar utbytet av näthinnevävnader och främjar repeterbarhet. I den andra delen av induktionen organiserar optiska blåsor (OVs) själv i följsamhetskulturen och ROs bildas i suspensionskulturen; Tidskurserna och effektivitetsvinsterna i denna del varierar avsevärt i olika hPSC-linjer. Mognad och specifikation av näthinneceller i ROs förekommer huvudsakligen i mitten och sent skede av induktion. Utan tillägg av RA kan mogna fotoreceptorer med både rika koner och stavar produceras.
Syftet med detta protokoll är att kvantitativt beskriva och beskriva varje steg för oerfarna forskare att upprepa. Olika hPSC linjer har framgångsrikt inducerats till ROs genom detta protokoll med en robust avkastning av kon-rika näthinnan vävnader och hög repeterbarhet. HPSCs-härledda ROs med detta protokoll kan rekapitulera de viktigaste stegen för retinal utveckling in vivo, och överleva långsiktiga, vilket underlättar nedströms applikationer, såsom sjukdom modellering, läkemedelsscreening, och cellterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta flerstegs retinal induktion protokoll, hPSCs guidades steg för steg för att få näthinnan ödet och självorganiserade i retinal organoider som innehåller laminerade NR och RPE. Under differentiering, hPSCs recapitulated alla större steg av mänskliga retinal utveckling in vivo, från EF, OV och RPE, till retinal laminering, generera alla subtyper av retinal celler, inklusive retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolära celler, stav och kon fotoreceptorer och muller gliaceller i en rumslig oc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science & Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundra talangprogram av Sun Yat-sen University (PT1001010) och fundamentala forskningsfonderna för statens nyckellaboratorium för oftalmologi.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
Referências
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber’s congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
