İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi
Summary
Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.
Abstract
Retina dejeneratif hastalıklar etkili bir tedavi olmadan geri dönüşü olmayan körlüğün başlıca nedenleridir. Her türlü retina hücresine, hatta mini retina dokularına farklılaşma potansiyeline sahip pluripotent kök hücreler, bu hastalıklara sahip hastalar ve hastalık modelleme ve ilaç taramasında birçok fırsat için büyük vaatlerde bulunmaktadır. Bununla birlikte, hPSC’lerden retina hücrelerine indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücreleri için uygun, yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilik ile retina dokuları oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, koni fotoreceptörlerinin zenginleştirilmesine fayda sağlayan retinoik asit eklenmeden gerçekleştirilir. Bu protokolün avantajı, retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir. Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Hastalık modellemesi ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retinitis pigmentosa (RP) gibi retina dejeneratif hastalıklar (RD), fotoreceptör hücrelerinin işlev bozukluğu ve ölümü ile karakterizedir ve tipik olarak tedavi etmenin etkili yolları olmadan geri dönüşü olmayan görme kaybına yol açar1. Bu hastalıkların altında kalan mekanizma, insan hastalığı modellerinin eksikliği nedeniyle kısmen bilinmemektedir2. Son on yılda kök hücre teknolojisi ile rejeneratif tıpta önemli ilerlemeler kaydedildi. Biz de dahil olmak üzere birçok araştırmacı, insan embriyonik kök hücreleri (hESC’ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC’ler) dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC’ler), çeşitli farklılaşma yaklaşımları3 , 4 ,5,6,7,8,9,10, 11, hastalık modelleme ve hücre tedavisi büyük potansiyel sağlayan12,13,14.
Bununla birlikte, hPSC’lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci, zengin deneyime ve yüksek becerilere sahip araştırmacılar gerektiren düşük tekrarlanabilirlik ile oldukça karmaşık ve zaman alıcıdır. Karmaşık ve dinamik indüksiyon işlemi sırasında, bir dizi faktör retina dokularının verimini etkileyecektir15,16,17. Ayrıca, farklı indüksiyon yöntemleri genellikle retina işaretleyicilerinin zamanlaması ve sağlam ifadesi açısından önemli ölçüde değişir, bu da örnek toplama ve veri yorumlamayı şaşırtabilir3. Bu nedenle, adım adım rehberlik ile hPSC’lerden retina farklılaşması için basit bir protokol talep edilecektir.
Burada, yayınlanan çalışmalarımıza dayanarak18,19,20,21 , hPSC’lerden zengin koni fotoreseptörleri ile retinal organoidler (ROs) oluşturmak için optimize edilmiş bir retina indüksiyon protokolü tanımlanmıştır, bu da retinoik asit (RA) takviyesi gerektirmez. Bu protokol, nöral retina ve RPE oluşturmak için çok adımlı yöntemin açıklamasına odaklanır. EB oluşumu erken indüksiyon aşamasının önemli bir parçasıdır. EBs’nin hem boyutu hem de kaplama yoğunluğu, retina dokularının verimini bilimsel olarak artıran ve tekrarlanabilirliği teşvik eden nicel olarak optimize edilmiştir. İndüksiyonun ikinci bölümünde, optik veziklinler (OV’ler) yapışma kültüründe kendi kendine organize olur ve süspansiyon kültüründe ROs formu; bu kısmın zaman kursları ve verimlilikleri farklı hPSC hatlarında önemli ölçüde farklılık gösterir. RO’lardaki retina hücrelerinin olgunlaşması ve spesifikasyonu esas olarak indüksiyonun orta ve geç aşamasında ortaya çıkar. RA ilavesi olmadan, hem zengin konilere hem de çubuklara sahip olgun fotoreceptörler üretilebilir.
Bu protokolün amacı, deneyimsiz araştırmacıların tekrar etmesi için her adımı nicel olarak tanımlamak ve detaylandırmaktır. Koni bakımından zengin retina dokularının sağlam verimi ve yüksek tekrarlanabilirlik ile çeşitli hPSC hatları bu protokol ile ROs’a başarıyla indüklenmiştir. Bu protokole sahip HPSC’lerden türetilmiş RO’lar, retinagelişiminin ana adımlarını in vivo olarak yeniden özetleyebilir ve hastalık modelleme, ilaç taraması ve hücre tedavisi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştıran uzun süreli hayatta kalabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çok adımlı retina indüksiyon protokolünde, hPSC’ler retina kaderini kazanmak için adım adım yönlendirildi ve lamine NR ve RPE içeren retina organoidleri halinde kendi kendine organize edildi. Farklılaşma sırasında, hPSC’ler,ef, OV ve RPE’den retina laminasyonuna kadar insan retina gelişiminin tüm önemli adımlarını yeniden bir araya getiren, retina ganglion hücreleri, amakrin hücreleri, bipolar hücreler, çubuk ve koni fotoreceptörleri ve muller glial hücreler de dahil olmak üzere ret…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2016YFC110103, 2017YFA0104101), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Proje Fonu (201803010078), Guangdong Eyaleti Bilim ve Teknoloji Projesi (2017B02020230003), Çin Doğa Bilimleri Vakfı (NSF) (81570874, 81970842), Sun Yat-sen Üniversitesi’nin (PT1001010) Yüz yetenek programı ve Oftalmoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı Temel Araştırma Fonları.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
Referências
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber’s congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
