Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.
Retinale degeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van onomkeerbare blindheid zonder effectieve behandeling. Pluripotente stamcellen die het potentieel hebben om te differentiëren in alle soorten retinale cellen, zelfs mini-retinale weefsels, houden enorme beloften in voor patiënten met deze ziekten en vele mogelijkheden in ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Het inductieproces van hPSC’s naar retinale cellen is echter ingewikkeld en tijdrovend. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinaal inductieprotocol om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren, geschikt voor verschillende menselijke pluripotente stamcellen. Dit protocol wordt uitgevoerd zonder de toevoeging van retinoïnezuur, wat de verrijking van kegelfotoreceptoren ten goede komt. Het voordeel van dit protocol is de kwantificering van EB-grootte en platingdichtheid om de efficiëntie en herhaalbaarheid van retinale inductie aanzienlijk te verbeteren. Met deze methode verschijnen alle belangrijke retinale cellen sequentieel en vatten ze de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling samen. Het zal downstream-toepassingen vergemakkelijken, zoals ziektemodellering en celtherapie.
Retinale degeneratieve ziekten (ED’s), zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en retinitis pigmentosa (RP), worden gekenmerkt door de disfunctie en dood van fotoreceptorcellen en leiden meestal tot onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen zonder effectieve manieren om te genezen1. Het mechanisme dat aan deze ziekten ten grondslag ligt, is grotendeels onbekend, deels als gevolg van een gebrek aan menselijke ziektemodellen2. In de afgelopen decennia zijn er aanzienlijke vorderingen geboekt in de regeneratieve geneeskunde door middel van stamceltechnologie. Veel onderzoekers, waaronder wijzelf, hebben aangetoond dat menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s), inclusief menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s), kunnen differentiëren in alle soorten retinale cellen, zelfs mini-retinale weefsels door verschillende differentiatiebenaderingen3,4,5,6,7,8,9,10, 11, biedt een enorm potentieel in ziektemodellering en celtherapie12,13,14.
Het inductieproces van hPSC’s naar retinale cellen is echter zeer gecompliceerd en tijdrovend met een lage herhaalbaarheid, wat onderzoekers met rijke ervaring en hoge vaardigheden vereist. Tijdens het complexe en dynamische inductieproces zullen een aantal factoren de opbrengst van retinale weefselsbeïnvloeden 15,16,17. Ook variëren verschillende inductiemethoden vaak aanzienlijk in timing en robuuste expressie van retinale markers, wat de monsterverzameling en gegevensinterpretatie kan verstoren3. Daarom zou een eenvoudig protocol van retinale differentiatie van hPSC’s met stapsgewijze begeleiding in trek zijn.
Hier, op basis van onze gepubliceerde studies18,19,20,21,wordt een geoptimaliseerd retinale inductieprotocol beschreven om retinale organoïden (RO’s) te genereren met rijke kegelfotoreceptoren van hPSC’s, waarvoor geen supplement van retinoïnezuur (RA) nodig is. Dit protocol richt zich op de beschrijving van de meerstappenmethode om neuraal netvlies en RPE te genereren. EB-vorming is het essentiële onderdeel van de vroege inductiefase. Zowel de grootte als de platingdichtheid van EB’s zijn kwantitatief geoptimaliseerd, wat de opbrengst van retinale weefsels wetenschappelijk verbetert en de herhaalbaarheid bevordert. In het tweede deel van de inductie organiseren optische blaasjes (OVs) zichzelf in de therapietrouwcultuur en vormen zich ERRO’s in de suspensiecultuur; de tijdscursussen en efficiëntie van dit deel variëren aanzienlijk in verschillende hPSC-lijnen. De rijping en specificatie van retinale cellen in RA’s vindt voornamelijk plaats in het middelste en late stadium van inductie. Zonder de toevoeging van RA kunnen volwassen fotoreceptoren met zowel rijke kegels als staafjes worden geproduceerd.
Het doel van dit protocol is om elke stap kwantitatief te beschrijven en te detailleren voor onervaren onderzoekers om te herhalen. Verschillende hPSC-lijnen zijn met succes geïnduceerd in RO’s door dit protocol met een robuuste opbrengst van kegelrijke retinale weefsels en een hoge herhaalbaarheid. HPSC-afgeleide RO’s met dit protocol kunnen de belangrijkste stappen van retinale ontwikkeling in vivosamenvatten en op lange termijn overleven, wat downstream-toepassingen vergemakkelijkt, zoals ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en celtherapie.
In dit multi-step retinale inductieprotocol werden hPSC’s stap voor stap begeleid om het retinale lot te verkrijgen en zelf georganiseerd in retinale organoïden met gelamineerde NR en RPE. Tijdens de differentiatie hebben hPSC’s alle belangrijke stappen van de menselijke retinale ontwikkeling in vivosamengevat , van EF, OV en RPE tot retinale laminatie, waarbij alle subtypen retinale cellen worden gegenereerd, inclusief retinale ganglioncellen, amacrinecellen, bipolaire cellen, staaf- en kegelfotoreceptoren en …
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door het National Key R & D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), het Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), het Science & Technology Project van de provincie Guangdong (2017B020230003), de Natural Science Foundation (NSF) van China (81570874, 81970842), honderd talentprogramma van Sun Yat-sen University (PT1001010) en de Fundamental Research Funds van het State Key Laboratory of Ophthalmology.
(−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |