Конфокальный лазерный сканирующий анализ распределения Aspergillus fumigatus Conidia на основе конидии в оптически очищенном легком мыши с оптическим креплением
Summary
Описан метод количественного анализа распределения Aspergillus fumigatus conidia (размером 3 мкм) в дыхательных путях мышей. Метод также может быть использован для анализа распределения микрочастиц и агломерата наночастиц в дыхательных путях в различных моделях патологических состояний.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia являются воздушно-капельными патогенами, которые могут проникать в дыхательные пути человека. Иммунокомпетентные люди без аллергии проявляют резистентность и иммунологическую толерантность, в то время как у пациентов с ослабленным иммунитетом конидии могут колонизировать дыхательные пути и вызывать тяжелые инвазивные респираторные расстройства. Различные клетки в разных отсеках дыхательных путей участвуют в иммунном ответе, который предотвращает грибковую инвазию; однако пространственно-временные аспекты элиминации патогенов до сих пор не полностью поняты. Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых органов, особенно легких экспериментальных мышей, позволяет обнаруживать флуоресцентно меченые патогены в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения. В настоящем исследовании мы описываем экспериментальную установку для выполнения количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM), мы проследили расположение флуоресцентно меченых конидий в бронхиальных ветвях и альвеолярном отсеке через 6 часов после применения орофарингеальной части мышам. Описанный здесь подход ранее использовался для обнаружения точного местоположения патогена и идентификации патоген-взаимодействующих клеток на разных фазах иммунного ответа. Экспериментальная установка может быть использована для оценки кинетики элиминации возбудителя при различных патологических состояниях.
Introduction
Ежедневно люди вдыхают воздушно-капельные патогены, в том числе споры условно-патогенных грибов Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), которые могут проникать в дыхательныепути1. Дыхательные пути млекопитающих представляют собой систему дыхательных путей разных поколений, которые характеризуются различным строением стенок дыхательных путей2,3,4. Стенки трахеобронхиальной клетки состоят из нескольких типов клеток, среди которых находятся реснитчительные клетки, обеспечивающие мукоцилиарный клиренс5. В альвеолах отсутствуют реснитительные клетки и проникающие в альвеолярное пространство патогены не могут быть устранены мукоцилиарным клиренсом6. Кроме того, каждое поколение дыхательных путей является нишей для нескольких популяций иммунных клеток, и подмножества этих популяций уникальны для определенных отсеков дыхательных путей. Таким образом, альвеолярные макрофаги находятся в альвеолярных компартментах, в то время как трахея и проводящие дыхательные пути выстланы интраэпителиальными дендритными клетками7,8.
Приблизительный размер A. fumigatus conidia составляет 2-3,5 мкм9. Поскольку диаметр мелких дыхательных путей у человека и даже у мышей превышает 3,5 мкм, было высказано предположение, что конидии могут проникать в альвеолярное пространство2,10,11. На самом деле гистологическое исследование показало грибковый рост в альвеолах пациентов, страдающих аспергиллезом12. Конидии также были обнаружены в альвеолах инфицированных мышей с использованием живой визуализации толстых срезов легких13. Одновременно конидии были обнаружены в просветной стороне эпителия бронхов мышей14.
Трехмерная (3D) визуализация оптически очищенных целых легких мыши позволяет проводить морфометрический анализ дыхательных путей15. В частности, количественный анализ распределения висцерального плеврального нерва проводили с использованием оптически очищенных образцов легких мышей15. Недавно Amich et al.16 исследовали рост грибков после интраназального применения конидий к мышам с ослабленным иммунитетом с использованием флуоресцентной микроскопии оптически очищенных образцов легких мышей. Точное расположение покоящихся конидий в дыхательных путях в разные моменты времени после заражения важно для выявления клеточных популяций, которые могут обеспечить достаточную противогрибковую защиту в определенных фазах воспаления. Однако из-за относительно небольших размеров пространственно-временные аспекты распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях характеризуются слабо.
Здесь мы представляем экспериментальную установку для количественного анализа распределения A. fumigatus conidia в дыхательных путях инфицированных мышей. Используя флуоресцентную конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) оптически очищенных легких мышей, получившей орофарингеальное применение флуоресцентно меченой A. fumigatus conidia, получаем 3D-изображения и выполняем обработку изображений. Используя 3D-визуализацию всей доли легкого, мы ранее показали распределение A. fumigatus conidia в проводящих дыхательных путях мышей через 72 часа после применения конидий8.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D-визуализация всего органа позволяет получить данные без вскрытия образца, что имеет большое значение для исследования пространственных аспектов анатомического распределения возбудителя в организме. Существует несколько методов и модификаций оптического очищения тканей, которые ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят профессора Свена Краппманна (Университетская клиника Эрлангена и FUA Эрланген-Нюрнберг, Германия) за предоставление штамма Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Авторы благодарят пресс-службу МФТИ. В.B. признает Министерство науки и высшего образования Российской Федерации (#075-00337-20-03, проект FSMG-2020-0003). Работа по визуализации и количественной оценке A. fumigatus conidia была поддержана RSF No 19-75-00082. Работа по визуализации дыхательных путей была поддержана РФФИ No 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
Referências
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
