पोर्सिन आंतों के म्यूकोसल एपिथेलियम में एमिनोपेप्टिडेस एन को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन
Summary
पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक का उपयोग करके उत्पादित पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में व्यक्त पुनः संयोजक एंटीबॉडी पोर्सिन एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन) प्रोटीन को पहचान और बांध सकते हैं।
Abstract
पोर्सिन एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन), एक झिल्ली-बाध्य मेटालोपेप्टिडेस जो छोटे आंतों के श्लेष्म में प्रचुर मात्रा में मौजूद है, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम निष्क्रियता या संरचनात्मक परिवर्तनों जैसे किसी भी हस्तक्षेप के बिना एक म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू कर सकता है। यह एपीएन को टीकों के विकास में एक आकर्षक उम्मीदवार बनाता है जो म्यूकोसल एपिथेलियम को चुनिंदा रूप से लक्षित करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एपीएन एंटरोटॉक्सिजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) एफ 4 और पारगम्य गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस दोनों के लिए एक रिसेप्टर प्रोटीन है। इस प्रकार, एपीएन एपीएन-विशिष्ट एंटीबॉडी के आधार पर एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्म या नए टीकों के विकास में वादा दिखाता है। इस अध्ययन में, हमने पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक और पुनः संयोजक एंटीबॉडी अभिव्यक्ति विधि का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के उत्पादन की तुलना की। हमने पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन और एक ई कोलाई अभिव्यक्ति बीएल 21 (डीई 3) तनाव का उपयोग करके एक स्थिर रूप से स्थानांतरित चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइन भी स्थापित की, जो पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन वेक्टर को परेशान करती है। परिणाम बताते हैं कि हाइब्रिडोमा का उपयोग करके उत्पादित पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और एमएबी में व्यक्त एंटीबॉडी एपीएन प्रोटीन को पहचान और बांध सकते हैं। यह विभिन्न एपीएन-विशिष्ट एपिटोप्स को लक्षित करने वाले चिकित्सीय विकास के लिए एपीएन रिसेप्टर फ़ंक्शन के आगे स्पष्टीकरण के लिए आधार प्रदान करता है।
Introduction
एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन), एक चांदनी एंजाइम जो मेटालोप्रोटीनेज एम 1 परिवार से संबंधित है, एंजाइम-निर्भर और एंजाइम-स्वतंत्रमार्गों 1,2 के माध्यम से ट्यूमर मार्कर, रिसेप्टर और सिग्नलिंग अणु के रूप में कार्य करता है। अपनी जैविक गतिविधि के नियमन के लिए विभिन्न बायोएक्टिव पेप्टाइड्स के एन-टर्मिनल एमिनो-एसिड अवशेषों को छोड़ने के अलावा, एपीएन विभिन्न भड़काऊ रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एपीएन एंटीजन प्रसंस्करण और छंटनी पेप्टाइड्स द्वारा प्रस्तुति में भाग लेता है जो प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स क्लास II अणुओं 2,3 से कसकर बंधते हैं। एपीएन कई सिग्नल ट्रांसडक्शन में भाग लेने वाले जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के साथ बंधकर, साइटोकिन स्राव को संशोधित करके और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4,5,6,7 में एफसी गामा रिसेप्टर-मध्यस्थता फागोसाइटोसिस में योगदान करके विरोधी भड़काऊ प्रभाव भी डालता है।
व्यापक रूप से वितरित झिल्ली-बाध्य एक्सोपेप्टिडेस के रूप में, एपीएन पोर्सिन छोटे आंतों के श्लेष्म में प्रचुर मात्रा में है और रिसेप्टर-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस 1,5,8 के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। एपीएन कोशिका प्रवेश के लिए पारगम्य गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस के स्पाइक प्रोटीन को पहचानता है और बांधता है, और मेजबान कोशिकाओं9,10,11 के साथ बैक्टीरिया के पालन को प्रभावित करने के लिए सीधे एंटरोटॉक्सिजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई एफ 4 फिम्ब्रिया के एफएईजी सबयूनिट के साथ बातचीत करता है। इस प्रकार, एपीएन वायरल और जीवाणु संक्रामक रोगों के उपचार में एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है।
1975 में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) उत्पादन के लिए हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी और अन्य रणनीतियों के विकास के बाद से, एमएबी का व्यापक रूप से इम्यूनोथेरेपी, दवा वितरण और निदान12,13,14 में उपयोग किया गया है। वर्तमान में, एमएबी का उपयोग सफलतापूर्वक बीमारियों, जैसे कैंसर, सूजन आंत्र रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस12,15 के इलाज के लिए किया जाता है। उनकी मजबूत आत्मीयता और विशिष्टता के कारण, एमएबी एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट (एडीसी) या नए टीकोंके विकास में आदर्श लक्ष्य हो सकते हैं। एपीएन प्रोटीन विशिष्ट कोशिकाओं को चुनिंदा एंटीजन देने के लिए महत्वपूर्ण है, और कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम निष्क्रियता, या संरचनात्मक परिवर्तन 5,8,18 सहित किसी भी हस्तक्षेप के बिना रोगजनकों के खिलाफ एक विशिष्ट और मजबूत म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकता है। इसलिए, एपीएन-विशिष्ट एमएबी पर आधारित चिकित्सीय उत्पाद बैक्टीरिया और वायरल संक्रमण के खिलाफ वादा दिखाते हैं। इस अध्ययन में, हम हाइब्रिडोमा तकनीक का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट एमएबी के उत्पादन का वर्णन करते हैं, और प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक वैक्टर का उपयोग करके एंटी-एपीएन पुनः संयोजक एंटीबॉडी (आरएबी) की अभिव्यक्ति करते हैं। परिणाम इंगित करता है कि एपीएन प्रोटीन को पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबीएस में व्यक्त दोनों आरएबी द्वारा पहचाना गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
म्यूकोसल प्रतिरक्षा का प्रेरण रोगजनकों का मुकाबला करने और विभिन्न बीमारियों की रोकथाम और उपचार में सबसे प्रभावी तरीकों में से एक है। एपीएन, आंतों के श्लेष्म में एक अत्यधिक व्यक्त झिल्ली-बाध्य प्रोटी…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को चीनी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (संख्या 32072820, 31702242), विदेशी अध्ययन के लिए जियांग्सू सरकार छात्रवृत्ति (जेएस 20190246) और यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन के उच्च-स्तरीय प्रतिभाओं से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जो विकास जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थान के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम द्वारा स्थापित एक परियोजना है।
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
Referências
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