Et langsigtet ex vitro 3D organoid kultursystem blev etableret fra musehæpatocytter. Disse organoider kan passage og genetisk manipuleres ved lentivirus infektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering.
Leveren er det største organ hos pattedyr. Det spiller en vigtig rolle i glukoseopbevaring, proteinsekretion, metabolisme og afgiftning. Som eksekutor for de fleste af leveren funktioner, primære hepatocytter har begrænset voksende kapacitet. Dette kræver, at der oprettes ex vivo hepatocyt ekspansion modeller for lever fysiologisk og patologisk forskning. Her isolerede vi murine hepatocytter med to trin af kollagenaseperfusion og etablerede en 3D-organoidkultur som ‘minilever’ for at generogulere cellecelleinteraktioner og fysiske funktioner. Organoiderne består af heterogene cellepopulationer, herunder forfædre og modne hepatocytter. Vi introducerer processen i detaljeret at isolere og kultur murine hepatocytter eller foster hepatocyt at danne organoider inden for 2-3 uger og vise, hvordan man passage dem ved mekanisk pipetter op og ned. Derudover vil vi også introducere, hvordan man fordøjer organoiderne i enkeltceller til lentivirusinfektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering. Organoiderne kan bruges til lægemiddelskærme, sygdomsmodellering og grundlæggende leverforskning ved at modellere leverbiologi og patobiologi.
Organoider er selvorganiserede, tredimensionelle (3D) in vitro-klynger, der omfatter selvfornyende stamceller og differentierede celler med flere slægter1,2. Organoiderne i mange organer er blevet etableret enten fra pluripotente eller voksne stamceller ved veldefinerede nichefaktorer, herunder tarmen, hjernen, tyktarmen, nyrerne, leveren, bugspytkirtlen, skjoldbruskkirtlen, maven, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoiderne generobrer fysiske cellefunktioner ved at efterligne enten udvikling (stammer fra embryonale eller inducerede pluripotente stamceller, PSC’er) eller homøostase / regenerering progression (stammer fra voksne stamceller, ASCs), som åbner nye veje i sygdomsforskning og terapi8,9.
Som det største organ hos pattedyr er leveren primært ansvarlig for opbevaring, metabolisme og afgiftning. To slags epitelcelletyper, hepatocytter og cholangiocytter, konstruere den grundlæggende enhed af en leverlobule. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% af leverfunktionen10. Selv om leveren har bemærkelsesværdig regenerering kapacitet, hurtigt tab af hepatocyt funktioner sker under traditionelle monolayer dyrkning af dysreguleret celle polarisering og dedifferentiation, hvilket øger behovet for forskere og klinikere til at opbygge ‘gap-bridging’ lever modeller i en skål. Indtil for nylig havde ex vivo-ekspansionsmodellerne fra primære hepatocytter imidlertid ikke været veletablerede11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale / inducerede pluripotente stamceller, fibroblast konvertering til hepatocyt-lignende celler, og væv-afledte celler. Udviklingen af leverorganoider øger anvendelsen af en in vitro-model til lægemiddelskærme og levertoksicitetsanalyser16,17.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til etablering af leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved at bruge denne protokol, vi oprettet en in vitro kultur system af hepatocyt organoider med to perfusioner af kollagenase. Disse organoider kan passeres for langsigtet ekspansion i flere måneder. Deres fysiologiske funktion er meget i overensstemmelse med hepatocytter. Derudover giver vi også en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører genmanipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA transduktion og CRISPR-Cas9-teknik ved hjælp af organoider. Udbredelsen af hepatocytorganoider kaster lys over muligheden for at bruge organoider til at forstå leverbiologi og udvikle personlige og translationelle medicintilgange.
Evnen til at kultur modne hepatocytter over lange perioder er grundlæggende i at studere lever grundlæggende videnskab, narkotika toksikologi og hepatotropiske host-mikrobiologi infektioner såsom malaria og hepatitis virus. Med en veldefineret niche opretter protokollen her et kultursystem for hepatocytter. Denne protokol driver modne hepatocytter til at udvide i 3D-kultur med en heterogenitet, der opsummerer celle-celle interaktion, de fleste hepatocyt funktion og genetiske modifikationer, så design af genfunktion u…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Hans Clevers for venligt at give cellelinjer til at producere rekombinant R-spondin1. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key R &D Program of China (2019YFA01111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) til H.H., og Fondene for Ungdomsinterdisciplinær og Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) til H.H.
Perfusion Buffer | |||
EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
Digestion Buffer | |||
CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
Tip-wash Buffer | |||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
Wash Medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Culture Medium | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
Others | |||
0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
16 # silicone tube | LangerPump | ||
24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
37 °C Water Bath | |||
70 µm filter | BD | 352350 | |
Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |