Создание и генетическое манипулирование органоидами мышиных гепатоцитов
Summary
Из мышиных гепатоцитов была создана долгосрочная система 3D органоидных культур ex vitro . Эти органоиды могут быть пройдены и генетически обработаны лентивирусной инфекцией шРНК/эктопической конструкции, трансфекцией siRNA и инженерией CRISPR-Cas9.
Abstract
Печень является самым крупным органом у млекопитающих. Он играет важную роль в хранении глюкозы, секреции белка, метаболизме и детоксикации. Как исполнитель для большинства функций печени, первичные гепатоциты имеют ограниченную пролиферирующую способность. Это требует установления моделей расширения гепатоцитов ex vivo для физиологических и патологических исследований печени. Здесь мы выделили мышиные гепатоциты двумя этапами перфузии коллагеназы и создали 3D-органоидную культуру как «мини-печень» для рекапитуляции клеточно-клеточных взаимодействий и физических функций. Органоиды состоят из гетерогенных клеточных популяций, включая предшественников и зрелые гепатоциты. Мы подробно вводим процесс выделения и культивирования мышиных гепатоцитов или фетальных гепатоцитов с образованием органоидов в течение 2-3 недель и показываем, как проходить их путем механического пипетирования вверх и вниз. Кроме того, мы также представим, как переваривать органоиды в отдельные клетки для лентивирусной инфекции шРНК/ эктопической конструкции, трансфекции siRNA и инженерии CRISPR-Cas9. Органоиды могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и фундаментальных исследований печени путем моделирования биологии печени и патобиологии.
Introduction
Органоиды представляют собой самоорганизованные, трехмерные (3D) кластеры in vitro, которые включают самообновляющиеся стволовые клетки и многолинейные дифференцированные клетки1,2. Органоиды многих органов были установлены либо из плюрипотентных, либо из взрослых стволовых клеток с помощью четко определенных нишевых факторов, включая кишечник, мозг, толстую кишку, почки, печень, поджелудочную железу, щитовидную железу, желудок, кожу и легкие3,4,5,6,7 . Органоиды рекапитулируют функции физических клеток, имитируя либо развитие (происходящее из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, PSC), либо прогрессирование гомеостаза / регенерации (происходящее из взрослых стволовых клеток, ASC), что открывает новые возможности в исследованиях и терапии заболеваний8,9.
Как самый большой орган у млекопитающих, печень в основном отвечает за хранение, метаболизм и детоксикацию. Два типа эпителиальных клеток, гепатоциты и холангиоциты, конструируют основную единицу дольки печени. Гепатоциты отвечают за 70-80% функции печени10. Хотя печень обладает замечательной способностью к регенерации, быстрая потеря особенностей гепатоцитов происходит во время традиционного монослойного культивирования путем дисрегулируемой поляризации клеток и дедифференциации, что увеличивает потребность исследователей и клиницистов в построении моделей печени в чашке. Однако до недавнего времени модели расширения ex vivo из первичных гепатоцитов не были хорошо установлены11,12,13,14,15. Органоиды печени могут быть установлены из эмбриональных / индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, превращения фибробластов в гепатоцитоподобные клетки и клеток тканевого происхождения. Развитие органоидов печени стимулирует применение модели in vitro для скрининга лекарств и анализов токсичности печени16,17.
Здесь мы опишем подробный протокол установления органоидов печени из первичных гепатоцитов мышей. Используя этот протокол, мы создали культуральную систему in vitro из органоидов гепатоцитов с двумя перфузиями коллагеназы. Эти органоиды могут быть пройдены для долгосрочного расширения в течение нескольких месяцев. Их физиологическая функция в значительной степени согласуется с гепатоцитами. Кроме того, мы также предоставляем подробное описание того, как выполнять генетические манипуляции, такие как лентивирусная инфекция, трансдукция siRNA и инженерия CRISPR-Cas9 с использованием органоидов. Распространение органоидов гепатоцитов пролило свет на возможность использования органоидов для понимания биологии печени и разработки персонализированных и трансляционных подходов к медицине.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность культивировать зрелые гепатоциты в течение длительных периодов времени имеет основополагающее значение для изучения фундаментальной науки о печени, токсикологии лекарств и гепатотропных микробиологических инфекций, таких как малярия и вирусы гепатита. Имея четко опред?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессора Ханса Клеверса за любезное предоставление клеточных линий для получения рекомбинантного R-спондина1. Эта работа была поддержана грантами Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA0111400), Национального фонда естественных наук Китая (31970779) для H.H. и Группы междисциплинарных и инновационных исследований Фондов для молодежи Шаньдунского университета (2020QNQT003) до H.H.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
Referências
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
