Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme menschlicher Aortenklappen, die während chirurgischer Aortenklappenersatzverfahren oder aus Leichengewebe extrahiert werden, und die anschließende Isolierung, Expansion und Charakterisierung patientenspezifischer primärer Klappenendothel- und interstitieller Zellen. Enthalten sind wichtige Details zu den Prozessen, die erforderlich sind, um die Zelllebensfähigkeit und Phänotypspezifität sicherzustellen.
Abstract
Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist bei fast einem Drittel der älteren Bevölkerung vorhanden. Verdickung, Versteifung und Verkalkung der Aortenklappe verursacht Aortenstenose und trägt zu Herzinsuffizienz und Schlaganfall bei. Die Krankheitspathogenese ist multifaktoriell, und Belastungen wie Entzündungen, extrazelluläres Matrixumbau, turbulenter Fluss und mechanische Belastung und Belastung tragen zur osteogenen Differenzierung von Klappendothel- und Klappeninterstitialzellen bei. Die genauen auslösenden Faktoren, die den osteogenen Übergang einer gesunden Zelle in eine kalzifizierende Zelle vorantreiben, sind jedoch nicht vollständig definiert. Weiterhin ist die einzige aktuelle Therapie bei CAVD-induzierter Aortenstenose der Aortenklappenersatz, bei dem die native Klappe entfernt wird (chirurgischer Aortenklappenersatz, SAVR) oder eine vollständig zusammenklappbare Ersatzklappe über einen Katheter eingeführt wird (Transkatheter-Aortenklappenersatz, TAVR). Diese chirurgischen Eingriffe sind mit hohen Kosten und ernsthaften Risiken verbunden. Daher ist die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele für die Wirkstoffforschung unerlässlich. Zu diesem Zweck entwickelt die vorliegende Studie einen Workflow, bei dem chirurgisch entferntes Gewebe von Patienten und Spenderkadavergewebe verwendet werden, um patientenspezifische primäre Linien von Herzklappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung zu erstellen. Dieses Protokoll führt die Verwendung einer Kühllagerlösung ein, die üblicherweise bei Organtransplantationen verwendet wird, um die Schäden zu reduzieren, die durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht werden, mit dem Vorteil, dass die Zellen des herausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass isolierte Klappenzellen ihre proliferative Kapazität und endothelialen und interstitiellen Phänotypen in Kultur über mehrere Tage nach der Klappenentfernung vom Spender behalten. Die Verwendung dieser Materialien ermöglicht die Sammlung von Kontroll- und CAVD-Zellen, aus denen sowohl Kontroll- als auch Krankheitszelllinien gebildet werden.
Introduction
Die kalzifische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine chronische Pathologie, die durch Entzündung, Fibrose und Makroverkalzifizierung von Aortenklappenflügeln gekennzeichnet ist. Ein fortschreitender Umbau und eine Verkalkung der Blättchen (Aortensklerose genannt) kann zur Behinderung des Blutflusses (Aortenstenose) führen, was zum Schlaganfall beiträgt und zu Herzversagen führt. Derzeit ist die einzige Behandlung für CAVD der chirurgische oder Transkatheter-Aortenklappenersatz (SAVR bzw. TAVR). Es gibt keine nicht-chirurgische Möglichkeit, die CAVD-Progression zu stoppen oder umzukehren, und ohne Klappenersatz nähern sich die Sterblichkeitsraten innerhalb von 2-3 Jahren 50% 1,2,3. Die Definition der zugrunde liegenden Mechanismen, die dieser Pathologie zugrunde liegen, wird potenzielle neue therapeutische Ansätze identifizieren.
Bei einem gesunden Erwachsenen sind die Aortenklappenflügel etwa einen Millimeter dick und ihre Hauptfunktion besteht darin, den unidirektionalen Blutfluss aus dem linken Ventrikel aufrechtzuerhalten4. Jedes der drei Blättchen besteht aus einer Schicht von Klappendothelzellen (VECs), die die äußere Oberfläche des Blattes auskleidet und als Barriere fungiert. VECs halten die Klappenhomöostase aufrecht, indem sie die Permeabilität, die entzündliche Zelladhäsion und die parakrine Signalisierung regulieren 5,6,7. Klappeninterstitielle Zellen (VICs) umfassen die Mehrheit der Zellen innerhalb des Klappenblattes8. VICs sind in drei unterschiedlichen Schichten in der Packungsbeilage angeordnet. Diese Schichten sind als Ventricularis, Spongiosa und Fibrosa9 bekannt. Die Ventricularis ist dem linken Ventrikel zugewandt und enthält Kollagen- und Elastinfasern. Die mittlere Schicht, die Spongiosa, enthält einen hohen Proteoglykangehalt, der während des Herzzyklus für Scherflexibilität sorgt. Die äußere Fibrosaschicht befindet sich in der Nähe der Ausflussoberfläche auf der Aortenseite und ist reich an fibrillärem Kollagen Typ I und Typ III, das Kraft zur Aufrechterhaltung der Koaptation während der Diastole10,11,12 bietet. VICs befinden sich in einem Ruhezustand, jedoch können Faktoren wie Entzündungen, Umbau der extrazellulären Matrix (ECM) und mechanischer Stress die VIC-Homöostase 8,9,13,14,15,16 stören. Mit Verlust der Homöostase aktivieren und erwerben VICs einen myofibroblastenähnlichen Phänotyp, der zur Proliferation, Kontraktion und Sekretion von Proteinen fähig ist, die das extrazelluläre Millieu17 umgestalten. Aktivierte VICs können in kalzifizierende Zellen übergehen, was an die Differenzierung einer mesenchymalen Stammzelle (MSC) in einen Osteoblasten 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25 erinnert.
Die Verkalkung scheint in der kollagenreichen Fibrosaschicht durch Beiträge von VECs und VICs zu beginnen, dehnt sich jedoch aus und dringt in die anderen Schichten des Blättchensein 8. So ist es klar, dass sowohl VECs als auch VICs auf Reize reagieren, um die Expression osteogener Gene hochzuregulieren, aber die genauen Ereignisse, die die Aktivierung osteogener Gene vorantreiben, sowie das komplexe Zusammenspiel zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix des Blättchens bleiben unklar. Murine Modelle sind keine ideale Quelle, um nicht-genetische Treiber der CAVD-Pathogenese zu untersuchen, da Mäuse kein CAVD de novo26,27 entwickeln, daher ist die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und den aus diesen Geweben isolierten primären Zelllinien notwendig. Insbesondere ist es unerlässlich, diese Zellen in hoher Anzahl und guter Qualität zu erhalten, da sich das Feld der 3D-Zellkulturen und der Organoidmodellierung erweitert und wahrscheinlich zu einer ex vivo humanbasierten Alternative zu Mausmodellen wird.
Der Zweck der vorliegenden Methode besteht darin, einen Workflow zu teilen, der die Bedingungen für die effiziente Isolierung und Züchtung von VECs und VICs, die aus chirurgisch entfernten Ventilen von menschlichen Spendern gewonnen werden, geschaffen hat. Frühere Studien haben eine erfolgreiche Isolierung von VECs und VICs aus Schweineklappen28 und murinen Klappen29 gezeigt, nach unserem Wissen ist dies die erste, die die Isolierung dieser Zellen in menschlichem Gewebe beschreibt. Das hier beschriebene Protokoll ist auf menschliche herausgeschnittene Klappen anwendbar und umgeht und verbessert den Schaden, der durch die oft lange Beschaffungszeit zwischen der Gewebeentfernung und der Laborverarbeitung verursacht wird, erheblich, indem es die Verwendung einer Kühllagerlösung einführt, einer gepufferten Lösung, die klinisch bei Organtransplantationen verwendet wird und die Zellen des ausgeschnittenen Gewebes stark stabilisiert. Das hier beschriebene Protokoll zeigt auch, wie der Zellphänotyp bestimmt und eine hohe Effizienz des Zellüberlebens bei minimaler Zellkreuzkontamination gewährleistet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gewinnung von Kontroll- und Krankheitsgewebe vom Menschen ist entscheidend für die In-vitro- und Ex-vivo-Krankheitsmodellierung. Während man jedoch oft über die Herausforderungen spricht, die Lücke zwischen Bank und Krankenbett zu überbrücken, ist die umgekehrte Reihenfolge – vom OP-Raum zur Bank – oft genauso entmutigend. Wesentlich für einen Grundlagenwissenschaftler, um primäre menschliche Gewebeproben zu erhalten, ist eine Zusammenarbeit mit einem investierten Chirurgenwissenschaftler, der über ein Team …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jason Dobbins für die aufschlussreiche Diskussion und kritische Lektüre dieses Manuskripts. Wir möchten dem Center for Organ Recovery and Education für seine Hilfe und Unterstützung danken und danken den Gewebespendern und ihren Familien, die diese Studie ermöglicht haben. Alle Patientenproben stammen von Personen, die an Studien teilnehmen, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Pittsburgh in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurden. Leichengewebe, das über das Center for Organ Recovery and Education (CORE) gewonnen wurde, wurde vom University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID) genehmigt.
Einige Figuren, die mit Biorender.com erstellt wurden.
CSH wird vom National Heart, Lung and Blood Institute K22 HL117917 und R01 HL142932, der American Heart Association 20IPA35260111 unterstützt.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Referências
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