यह प्रोटोकॉल सर्जिकल महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन प्रक्रियाओं के दौरान या कैडवेरिक ऊतक से निकाले गए मानव महाधमनी वाल्व के संग्रह का वर्णन करता है, और बाद में रोगी विशिष्ट प्राथमिक वाल्व एंडोथेलियल और अंतरालीय कोशिकाओं के अलगाव, विस्तार और लक्षण वर्णन करता है। सेल व्यवहार्यता और फेनोटाइप विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण विवरण शामिल हैं।
कैल्सीफिक महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी) बुजुर्ग आबादी के लगभग एक तिहाई में मौजूद है। महाधमनी वाल्व का मोटा होना, कठोरता और कैल्सीफिकेशन महाधमनी स्टेनोसिस का कारण बनता है और दिल की विफलता और स्ट्रोक में योगदान देता है। रोग रोगजनन बहुक्रियाशील है, और सूजन, बाह्य मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग, अशांत प्रवाह, और यांत्रिक तनाव और तनाव जैसे तनाव वाल्व एंडोथेलियल और वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं के ओस्टोजेनिक भेदभाव में योगदान करते हैं। हालांकि, सटीक शुरुआती कारक जो एक स्वस्थ कोशिका के ओस्टोजेनिक संक्रमण को कैल्सीफाइंग सेल में चलाते हैं, पूरी तरह से परिभाषित नहीं हैं। इसके अलावा, सीएवीडी-प्रेरित महाधमनी स्टेनोसिस के लिए एकमात्र वर्तमान चिकित्सा महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन है, जिससे देशी वाल्व को हटा दिया जाता है (सर्जिकल महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन, एसएवीआर) या कैथेटर (ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन, टीएवीआर) के माध्यम से पूरी तरह से ढहने योग्य प्रतिस्थापन वाल्व डाला जाता है। ये सर्जिकल प्रक्रियाएं उच्च लागत पर और गंभीर जोखिमों के साथ आती हैं; इस प्रकार, दवा की खोज के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करना अनिवार्य है। उस अंत तक, वर्तमान अध्ययन एक वर्कफ़्लो विकसित करता है जहां रोगियों और दाता शव ऊतकों से शल्य चिकित्सा से हटाए गए ऊतकों का उपयोग इन विट्रो रोग मॉडलिंग के लिए वाल्वुलर कोशिकाओं की रोगी-विशिष्ट प्राथमिक लाइनों को बनाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल एक कोल्ड स्टोरेज समाधान के उपयोग का परिचय देता है, जो आमतौर पर अंग प्रत्यारोपण में उपयोग किया जाता है, ताकि उत्पादित ऊतक की कोशिकाओं को बहुत स्थिर करने के लाभ के साथ ऊतक छांटने और प्रयोगशाला प्रसंस्करण के बीच अक्सर लंबे खरीद समय के कारण होने वाले नुकसान को कम किया जा सके। वर्तमान अध्ययन के परिणामों से पता चलता है कि पृथक वाल्व कोशिकाएं दाता से वाल्व हटाने के बाद कई दिनों तक संस्कृति में अपनी प्रोलिफेरेटिव क्षमता और एंडोथेलियल और अंतरालीय फेनोटाइप को बनाए रखती हैं। इन सामग्रियों का उपयोग नियंत्रण और सीएवीडी कोशिकाओं के संग्रह की अनुमति देता है, जिससे नियंत्रण और रोग सेल लाइनें दोनों स्थापित होती हैं।
कैल्सीफिक महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी) एक पुरानी विकृति है जो महाधमनी वाल्व पत्रक की सूजन, फाइब्रोसिस और मैक्रोकैल्सीफिकेशन की विशेषता है। पत्रकों के प्रगतिशील रीमॉडेलिंग और कैल्सीफिकेशन (जिसे महाधमनी स्क्लेरोसिस कहा जाता है) से रक्त प्रवाह (महाधमनी स्टेनोसिस) में रुकावट हो सकती है जो स्ट्रोक में योगदान देती है और दिल की विफलता की ओर ले जाती है। वर्तमान में सीएवीडी के लिए एकमात्र उपचार सर्जिकल या ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (एसएवीआर और टीएवीआर, क्रमशः) है। सीएवीडी प्रगति को रोकने या रिवर्स करने के लिए कोई गैर-सर्जिकल विकल्प नहीं है, और वाल्व प्रतिस्थापन के बिना, मृत्यु दर 2-3 वर्षों के भीतर 50% तक पहुंच जाती है। इस विकृति को चलाने वाले अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित करने से संभावित नवीन चिकित्सीय दृष्टिकोण की पहचान होगी।
एक स्वस्थ वयस्क में, महाधमनी वाल्व पत्रक लगभग एक मिलीमीटर मोटे होते हैं, और उनका मुख्य कार्य बाएं वेंट्रिकल 4 से रक्त के यूनिडायरेक्शनल प्रवाह को बनाएरखना है। तीन पत्रकों में से प्रत्येक में वाल्व एंडोथेलियल कोशिकाओं (वीईसी) की एक परत शामिल है जो पत्रक की बाहरी सतह को रेखाबद्ध करती है और एक बाधा के रूप में कार्य करती है। वीईसी पारगम्यता, भड़काऊ सेल आसंजन और पैराक्रिन सिग्नलिंग 5,6,7 को विनियमित करके वाल्व होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं। वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं (वीआईसी) में वाल्व पत्रक8 के भीतर अधिकांश कोशिकाएं शामिल हैं। वीआईसी को पत्रक में तीन विशिष्ट परतों में व्यवस्थित किया जाता है। इन परतों को वेंट्रिकुलरिस, स्पोंजियोसा और फाइब्रोसा9 के रूप में जाना जाता है। वेंट्रिकुलरिस बाएं वेंट्रिकल का सामना करता है और इसमें कोलेजन और इलास्टिन फाइबर होते हैं। मध्य परत, स्पोंजियोसा में उच्च प्रोटीओग्लाइकेन सामग्री होती है जो हृदय चक्र के दौरान कतरनी लचीलापन प्रदान करती है। बाहरी फाइब्रोसा परत महाधमनी पक्ष पर बहिर्वाह सतह के करीब स्थित है और टाइप 1 और टाइप 3 फाइब्रिलर कोलेजन में समृद्ध है जो डायस्टोलिक10,11,12 के दौरान कोप्टेशन को बनाए रखने की ताकत प्रदान करता है। वीआईसी एक क्वीसेंट अवस्था में रहते हैं, हालांकि, सूजन, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के रीमॉडेलिंग और यांत्रिक तनाव जैसे कारक वीआईसी होमियोस्टैसिस 8,9,13,14,15,16 को बाधित कर सकते हैं। होमियोस्टैसिस के नुकसान के साथ, वीआईसी एक मायोफाइब्रोब्लास्ट जैसे फेनोटाइप को सक्रिय और प्राप्त करते हैं जो प्रोटीन के प्रसार, संकुचन और स्राव में सक्षम होता है जो बाह्य मिलीयू17 को फिर से तैयार करता है। सक्रिय वीआईसी कैल्सीफाइंग कोशिकाओं में संक्रमण कर सकते हैं जो एक मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) के ओस्टियोब्लास्ट 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25 में विभेदन की याद दिलाता है।
कैल्सीफिकेशन कोलेजन युक्त फाइब्रोसा परत में वीईसी और वीआईसी दोनों के योगदान से शुरू होता है, लेकिन पत्रक 8 की अन्य परतों का विस्तार और आक्रमण करताहै। इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि वीईसी और वीआईसी दोनों ओस्टोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं, हालांकि, ओस्टोजेनिक जीन की सक्रियता को चलाने वाली सटीक घटनाएं, साथ ही कोशिकाओं और पत्रक के बाह्य मैट्रिक्स के बीच जटिल अंतःक्रिया, गलत परिभाषित रहती हैं। म्यूरिन मॉडल सीएवीडी रोगजनन के गैर-आनुवंशिक ड्राइवरों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श स्रोत नहीं हैं, क्योंकि चूहे सीएवीडी डी नोवो26,27 विकसित नहीं करते हैं, इसलिए प्राथमिक मानव ऊतकों और इन ऊतकों से अलग प्राथमिक सेल लाइनों का उपयोग आवश्यक है। विशेष रूप से, इन कोशिकाओं को उच्च संख्या और अच्छी गुणवत्ता में प्राप्त करना अनिवार्य है, क्योंकि 3 डी सेल संस्कृतियों और ऑर्गेनोइड मॉडलिंग का क्षेत्र बढ़ रहा है और मुराइन मॉडल के लिए एक पूर्व विवो मानव-आधारित विकल्प बनने की संभावना है।
वर्तमान विधि का उद्देश्य एक वर्कफ़्लो साझा करना है जिसने मानव दाताओं से शल्य चिकित्सा द्वारा हटाए गए वाल्वों से प्राप्त वीईसी और वीआईसी को कुशलतापूर्वक अलग करने और विकसित करने की शर्तों को स्थापित किया है। पिछले अध्ययनों ने पोर्सिन28 और मुराइन वाल्व29 से वीईसी और वीआईसी के सफल अलगाव को दिखाया है, हमारे ज्ञान के लिए यह मानव ऊतकों में इन कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करने वाला पहला है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मानव उत्पादित वाल्वों पर लागू होता है और कोल्ड स्टोरेज समाधान के उपयोग को पेश करके ऊतक छांटने और प्रयोगशाला प्रसंस्करण के बीच अक्सर लंबे समय तक खरीद समय के कारण होने वाले नुकसान को बहुत कम करता है और सुधारता है, एक बफर समाधान जो अंग प्रत्यारोपण में चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जाता है जो उत्पादित ऊतक की कोशिकाओं को बहुत स्थिर करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल यह भी दिखाता है कि सेल फेनोटाइप कैसे निर्धारित किया जाए और न्यूनतम सेल क्रॉस-संदूषण के साथ सेल अस्तित्व की उच्च दक्षता की गारंटी दी जाए।
मनुष्यों से नियंत्रण और रोग ऊतकों को प्राप्त करना इन विट्रो और पूर्व विवो रोग मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, जबकि कोई अक्सर बेंच से बेडसाइड के बीच की खाई को पाटने की चुनौतियों के बारे में बात कर?…
The authors have nothing to disclose.
हम इस पांडुलिपि की व्यावहारिक चर्चा और महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जेसन डोबिन्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम उनकी मदद और समर्थन के लिए सेंटर फॉर ऑर्गन रिकवरी एंड एजुकेशन को स्वीकार करना चाहते हैं और इस अध्ययन को संभव बनाने के लिए ऊतक दाताओं और उनके परिवारों को धन्यवाद देते हैं। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित अध्ययनों में नामांकित व्यक्तियों से सभी रोगी नमूने एकत्र किए जाते हैं। सेंटर फॉर ऑर्गन रिकवरी एंड एजुकेशन (CORE) के माध्यम से प्राप्त कैडवेरिक ऊतकों को पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय की कमेटी फॉर ओवरसाइट ऑफ रिसर्च एंड क्लिनिकल ट्रेनिंग (CORID) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
Biorender.com के साथ बनाए गए कुछ आंकड़े।
सीएसएच को नेशनल हार्ट, लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट के 22 एचएल 117917 और आर01 एचएल 142932, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 20आईपीए 35260111 द्वारा समर्थित किया गया है।
0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |