체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리
Summary
이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.
Abstract
석회성 대동맥 판막 질환(CAVD)은 노인 인구의 거의 3분의 1에 존재합니다. 대동맥 판막의 비후, 경화 및 석회화는 대동맥 협착을 유발하고 심부전 및 뇌졸중에 기여합니다. 질환 발병기전은 염증, 세포외 기질 리모델링, 난류, 및 기계적 스트레스 및 변형과 같은 다인성 및 스트레스가 판막 내피 및 판막 간질 세포의 골형성 분화에 기여한다. 그러나 건강한 세포의 석회화 세포로의 골형성 전이를 유도하는 정확한 개시 인자는 완전히 정의되지 않았습니다. 또한, CAVD 유발 대동맥 협착증에 대한 유일한 현재 치료법은 대동맥 판막 치환술이며, 이에 따라 천연 판막을 제거하거나(외과적 대동맥 판막 치환술, SAVR) 카테터를 통해 완전히 접을 수 있는 판막을 삽입한다(경피적 대동맥 판막 치환술, TAVR). 이러한 수술 절차에는 높은 비용과 심각한 위험이 따릅니다. 따라서 약물 발견을 위한 새로운 치료 표적을 식별하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 본 연구는 환자에서 외과적으로 제거된 조직과 기증자 사체 조직을 사용하여 체외 질환 모델링을 위한 판막 세포의 환자 특이적 기본 라인을 만드는 워크플로를 개발합니다. 이 프로토콜은 장기 이식에 일반적으로 사용되는 냉장 보관 용액의 활용을 도입하여 조직 절제와 실험실 처리 사이의 종종 긴 조달 시간으로 인한 손상을 줄이고 절제된 조직의 세포를 크게 안정화시키는 이점을 제공합니다. 본 연구의 결과는 단리된 판막 세포가 공여자로부터 판막을 제거한 후 수일 이상 배양물에서 그의 증식 능력 및 내피 및 간질 표현형을 유지한다는 것을 입증한다. 이러한 물질을 사용하면 대조군 및 CAVD 세포를 수집 할 수 있으며, 이로부터 대조군 및 질병 세포주가 모두 확립됩니다.
Introduction
석회성 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 염증, 섬유증 및 대동맥 판막 전단지의 거대 석회화를 특징으로하는 만성 병리학입니다. 전단지의 점진적인 리모델링 및 석회화 (대동맥 경화증이라고 함)는 뇌졸중에 기여하고 심부전으로 이어지는 혈류 차단 (대동맥 협착증)으로 이어질 수 있습니다. 현재 CAVD에 대한 유일한 치료법은 외과적 또는 경피적 대동맥 판막 치환술(각각 SAVR 및 TAVR)입니다. CAVD 진행을 중단하거나 역전시킬 수 있는 비수술적 옵션은 없으며, 판막 교체 없이 사망률은 2-3년 내에 50%에 접근합니다 1,2,3. 이 병리를 주도하는 기본 메커니즘을 정의하면 잠재적인 새로운 치료 접근 방식을 식별할 수 있습니다.
건강한 성인의 경우 대동맥 판막 전단지의 두께는 약 1mm이며 주요 기능은 좌심실4에서 혈액의 단방향 흐름을 유지하는 것입니다. 세 개의 전단지는 각각 전단지의 외부 표면을 감싸고 장벽 역할을하는 판막 내피 세포 (VEC) 층으로 구성됩니다. VEC는 투과성, 염증 세포 부착 및 파라 크린 신호 전달 5,6,7을 조절하여 밸브 항상성을 유지합니다. 판막 간질 세포(VIC)는 판막 소엽8 내의 대부분의 세포를 구성한다. VIC는 전단지에서 세 개의 독특한 레이어로 배열됩니다. 이 층은 심실, 해면상 및 섬유증9로 알려져 있습니다. 심실은 좌심실을 향하고 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 포함합니다. 중간층인 해면체는 심장 주기 동안 전단 유연성을 제공하는 높은 프로테오글리칸 함량을 포함합니다. 외부 섬유층은 대동맥 측의 유출 표면에 가깝게 위치하며 이완기10,11,12 동안 응고를 유지하는 강도를 제공하는 유형 I 및 유형 III 원 섬유 콜라겐이 풍부합니다. VIC는 정지 상태에 있지만 염증, 세포 외 기질 (ECM)의 리모델링 및 기계적 스트레스와 같은 요인이 VIC 항상성 8,9,13,14,15,16을 방해 할 수 있습니다. 항상성의 상실과 함께, VICs는 세포외 밀리ᄅ17을 리모델링하는 단백질의 증식, 수축 및 분비가 가능한 근섬유아세포-유사 표현형을 활성화시키고 획득한다. 활성화된 VIC는 중간엽 줄기세포(MSC)가 조골세포 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25로 분화된 것을 연상시키는 석회화 세포로 전환될 수 있습니다.
석회화는 VEC와 VIC 모두의 기여로부터 콜라겐이 풍부한 섬유사 층에서 시작되는 것으로 보이지만 전단지8의 다른 층을 확장하고 침범합니다. 따라서 VEC와 VIC가 모두 골 형성 유전자의 발현을 상향 조절하는 자극에 반응한다는 것은 분명하지만, 골 형성 유전자의 활성화를 유도하는 정확한 사건과 세포와 전단지의 세포 외 기질 사이의 복잡한 상호 작용은 아직 정의되지 않은 상태로 남아 있습니다. 쥐 모델은 CAVD denovo 26,27을 개발하지 않기 때문에 CAVD 발병 기전의 비 유전 적 동인을 연구하는 이상적인 공급원이 아니므로 일차 인간 조직과 이들 조직으로부터 분리 된 1 차 세포주의 사용이 필요합니다. 특히, 3D 세포 배양 및 오가노이드 모델링 분야가 확대되고 뮤린 모델에 대한 생체 외 인간 기반 대안이 될 가능성이 높기 때문에 이러한 세포를 높은 수와 우수한 품질로 얻는 것이 필수적입니다.
본 방법의 목적은 인간 기증자로부터 외과적으로 제거된 판막으로부터 얻은 VEC 및 VIC를 효율적으로 분리하고 성장시키기 위한 조건을 확립한 워크플로우를 공유하는 것이다. 이전 연구에서는 돼지28 및 뮤린 밸브29에서 VEC와 VIC를 성공적으로 분리하는 것으로 나타 났으며, 우리가 아는 한 이것은 인간 조직에서 이러한 세포의 분리를 설명하는 최초의 것입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 인간 절제 판막에 적용할 수 있으며 절제된 조직의 세포를 크게 안정화시키는 장기 이식에 임상적으로 활용되는 완충 용액인 냉장 보관 용액의 활용을 도입하여 조직 절제와 실험실 처리 사이의 종종 긴 조달 시간으로 인한 손상을 크게 우회하고 개선합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 또한 세포 표현형을 결정하고 최소한의 세포 교차 오염으로 세포 생존의 높은 효율성을 보장하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간으로부터 제어 및 질병 조직을 얻는 것은 시험관 내 및 생체 외 질병 모델링에 중요합니다. 그러나 벤치와 침대 옆 사이의 간격을 메우는 어려움에 대해 자주 이야기하는 반면, 수술실에서 벤치로 이동하는 역순은 종종 그 격차를 벅차게 만듭니다. 기초 과학자가 1차 인체 조직 표본을 얻는 데 필수적인 것은 간호사, 외과 기술자, 의사 보조, 의대생 및 레지던트, 임상 프로토콜 관리자로 구성?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고에 대한 통찰력 있는 토론과 비판적 읽기에 대해 Jason Dobbins에게 감사드립니다. 우리는 장기 회복 및 교육 센터의 도움과 지원에 감사하고 이 연구를 가능하게 한 조직 기증자와 그 가족에게 감사드립니다. 모든 환자 샘플은 헬싱키 선언에 따라 피츠버그 대학의 기관 검토위원회가 승인 한 연구에 등록 된 개인으로부터 수집됩니다. 장기 회복 및 교육 센터 (CORE)를 통해 얻은 사체 조직은 피츠버그 대학 사망자와 관련된 연구 및 임상 교육 감독위원회 (CORID)의 승인을 받았습니다.
Biorender.com 로 만든 일부 그림.
CSH는 National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 및 R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111에 의해 지원된다.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Referências
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