Модель трансплантации легких крысы при теплой ишемии/реперфузионной травме: оптимизация для улучшения исходов
Summary
Здесь мы представляем оптимизацию модели трансплантации легких крысы, которая служит для улучшения результатов. Мы предоставляем руководство по размеру манжет на основе массы тела, стратегию измерения для определения4-го межреберья, а также методы закрытия раны и сбора жидкости и тканей BAL (бронхоальвеолярный лаваж).
Abstract
Исходя из нашего опыта трансплантации легких крыс, мы нашли несколько областей для улучшения. Информация в существующей литературе о методах выбора подходящих размеров манжеты для легочной вены (PV), легочной артерии (PA) или бронха (Br) разнообразна, что делает определение правильного размера манжеты во время трансплантации легких крысы методом проб и ошибок. Стандартизировав технику манжеты, чтобы использовать наименьшую эффективную манжету, соответствующую размеру сосуда или бронха, можно сделать процедуру трансплантации более безопасной, быстрой и успешной. Поскольку диаметры PV, PA и Br связаны с массой тела крысы, мы представляем стратегию выбора подходящего размера с использованием руководства на основе веса. Поскольку объем легких также связан с массой тела, мы рекомендуем учитывать эту взаимосвязь при выборе правильного объема воздуха для надувания донорских легких во время теплой ишемии, а также для правильного объема PBS, который будет закапываться во время сбора жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ). Описаны методы рассечения4-го межреберья, закрытия раны и забора образцов как из нативных, так и из трансплантированных долей.
Introduction
На протяжении более трех десятилетий исследователи модифицировали и улучшали модели трансплантации легких крыс, чтобы полученные данные были более последовательными и более отражали фактическое клиническое состояние. За время работы нашей лаборатории с этой моделью мы определили четыре области улучшения: методы манжеты для анастомозов, идентификация4-го межреберья реципиента, раздувание легких и закрытие раны во время процедуры реципиента, а также сбор образцов для анализа.
Модификации техники манжеты для анастомозов могут улучшить всю процедуру трансплантации, сократив время обработки донорского легкого 1,2,3,4,5,6 и сделав процедуру анастомоза более быстрой и технически простой для микрохирурга. Несмотря на то, что крайне важно использовать манжеты правильного размера для подачи необходимой крови и воздушного потока в трансплантированное легкое, существует ограниченное руководство относительно того, как следует выбирать размер манжет для легочной вены (PV), легочной артерии (PA) или бронха (Br)5,7,8,9. Поскольку диаметры PV, PA и Br связаны с массой тела крыс-доноров и реципиентов, мы предлагаем, чтобы размер манжеты основывался на массе тела. В этом отчете представлено руководство по размеру манжет, основанное на массе тела крысы (от 180 г до более 270 г), которое служит для оптимизации кровоснабжения и подачи воздуха в трансплантированное легкое (таблица 1).
В то время как новый микрохирург может успешно и легко получить донорское легкое во время донорской процедуры, трансплантация легкого во время процедуры реципиента является более сложной и зависит от опыта микрохирурга. Попытки найти4-е межреберье для доступа к левому легкому реципиента являются одним из наиболее сложных шагов, который имеет некоторую субъективность и может увеличить время процедуры. Поэтому мы представляем простой и объективный метод, помогающий определить местоположение4-го межреберья с помощью измерений грудной клетки и сердцебиения, чтобы найти правильную область грудной стенки для рассечения 4,5,6,10,11,12.
Мы также предлагаем улучшить инфляцию донорских легких, которая является потенциальным источником повреждения органа. Донорское легкое сдувается до тех пор, пока не начнется реперфузия. При ушивании4-го межреберья донорское легкое обычно раздувают за счет увеличения PEEP с 2 см H 2 O до6 см H2O. Чтобы свести к минимуму повреждение легких из-за чрезмерного надувания, мы предлагаем технику, при которой три нейлоновых шва 6-0 накладываются вокруг4-го ребра, уступающего5-му ребру, с помощью простых двойных узлов. Когда приходит время закрытия раны, концы трех швов удерживаются гемостатами в обеих руках, рана закрывается сразу, подтягиваясь с каждой стороны, и PEEP немедленно уменьшается до 2 см H2O. Таким образом, легкое может расширяться в течение максимально короткого времени10.
В конце эксперимента исследователь часто хочет собрать много типов образцов для многих типов анализа из каждой трансплантации. Например, замороженная ткань, фиксированная ткань формалина, ткань для соотношения веса влажного и сухого для определения отека легких и жидкость бронхоальвелололярного лаважа (BAL) могут быть использованы для оценки того, насколько хорошо прошла трансплантация. Традиционный метод сбора жидкости BAL позволяет получить смешанный объединенный образец как из родных долей реципиента, так и из трансплантированной доли донора13,14,15. Чтобы преодолеть это, мы представляем метод зажима прикорневых областей, который может дать более точное представление о состоянии трансплантированных и родных легких. Кроме того, важно учитывать объем PBS, используемый для сбора жидкости BAL с каждой стороны легких, поскольку жидкость BAL содержит множество растворимых факторов, таких как цитокины и хемокины, которые измеряются концентрацией. Нормализация объема закапываемой жидкости до предполагаемого объема емкости легких может помочь в сравнении. С четырьмя лепестками с правой стороны и одной долей с левой стороны, каждая из пяти долей крысы имеет разный объем и площадь поверхности16. Согласно предыдущему исследованию по измерению объема долей легких, проведенному Backer et al., из общего объема всего легкого объем правых долей составляет 63% (4400мм3), а левая доля – 37% (2500 мм3). Поэтому мы рекомендуем, чтобы объем PBS, используемый для сбора жидкости BAL, рассчитывался как удвоенный дыхательный объем (7,2 мл / кг), умноженный на 63% для правого легкого и 37% для левого легкого. Используя этот подход, можно лучше контролировать такие переменные, как масса тела и время10,16.
В целом, в этом отчете мы продемонстрируем несколько модификаций стандартной экспериментальной модели трансплантации легких крысы, которые могут сделать процедуру более эффективной и увеличить возможности получения более точных и обильных данных из каждого эксперимента.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете мы вмешались на нескольких важных этапах протокола трансплантации легких крысы, чтобы оптимизировать процедуру. Несмотря на то, что сообщалось о различных методах манжеты для трансплантации легких крысы 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
Referências
- Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 97 (4), 578-581 (1989).
- Zhai, W., et al. Simplified rat lung transplantation by using a modified cuff technique. Journal of Investigative Surgery. 21 (1), 33-37 (2008).
- Goto, T., et al. Simplified rat lung transplantation using a new cuff technique. Annals of Thoracic Surgery. 93 (6), 2078-2080 (2012).
- Guo, H., et al. Improvements of surgical techniques in a rat model of an orthotopic single lung transplant. European Journal of Medical Research. 18, 1 (2013).
- Tian, D., Shiiya, H., Sato, M., Nakajima, J. Rat lung transplantation model: modifications of the cuff technique. Annals of Translational Medicine. 8 (6), 407 (2020).
- Rajab, T. K. Anastomotic techniques for rat lung transplantation. World Journal of Transplantation. 8 (2), 38-43 (2018).
- Reis, A., Giaid, A., Serrick, C., Shennib, H. Improved outcome of rat lung transplantation with modification of the nonsuture external cuff technique. Journal of Heart and Lung Transplantation. 14 (2), 274-279 (1995).
- Sugimoto, R., et al. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surgery Today. 39 (7), 641-645 (2009).
- Santana Rodriguez, N., et al. Technical modifications of the orthotopic lung transplantation model in rats with brain-dead donors. Archivos de Bronconeumología. 47 (10), 488-494 (2011).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Rajab, T. K. Techniques for lung transplantation in the rat. Experimental Lung Research. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Iskender, I., et al. Effects of Warm Versus Cold Ischemic Donor Lung Preservation on the Underlying Mechanisms of Injuries During Ischemia and Reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Lin, X., et al. Five-year update on the mouse model of orthotopic lung transplantation: Scientific uses, tricks of the trade, and tips for success. Journal of Thoracic Disease. 4 (3), 247-258 (2012).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicological Research. 26 (3), 203-208 (2010).
- Chang, J. E., Kim, H. J., Yi, E., Jheon, S., Kim, K. Reduction of ischemia-reperfusion injury in a rat lung transplantation model by low-concentration GV1001. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (5), 972-979 (2016).
- De Backer, J. W., et al. Study of the variability in upper and lower airway morphology in Sprague-Dawley rats using modern micro-CT scan-based segmentation techniques. Anatomical Record. 292 (5), 720-727 (2009).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), e52309 (2015).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. Journal of Visualized Experiments. (65), e3947 (2012).
- Jia, Y., et al. Treatment of acute lung injury by targeting MG53-mediated cell membrane repair. Nature Communications. 5, 4387 (2014).
- Kim, J. L., et al. Pegylated-Catalase Is Protective in Lung Ischemic Injury and Oxidative Stress. Annals of Thoracic Surgery. , (2020).
- Beal, E. W., et al. D-Ala(2), D-Leu(5)] Enkephalin Improves Liver Preservation During Normothermic Ex Vivo Perfusion. Journal of Surgical Research. 241 (2), 323-335 (2019).
- Akateh, C., et al. Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model. Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).
