Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

Summary

Demostramos cómo utilizar un nuevo instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas para estimar la distribución del tamaño y la concentración total de partículas de vesículas extracelulares aisladas de tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano.

Abstract

Los roles fisiológicos y fisiopatológicos de las vesículas extracelulares (EV) se han vuelto cada vez más reconocidos, lo que hace que el campo EV sea un área de investigación en rápida evolución. Existen muchos métodos diferentes para el aislamiento de vehículos eléctricos, cada uno con ventajas y desventajas distintas que afectan el rendimiento y la pureza posteriores de los vehículos eléctricos. Por lo tanto, la caracterización de la preparación ev aislada de una fuente dada por un método elegido es importante para la interpretación de los resultados posteriores y la comparación de los resultados entre laboratorios. Existen varios métodos para determinar el tamaño y la cantidad de vehículos eléctricos, que pueden verse alterados por estados de enfermedad o en respuesta a afecciones externas. El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) es una de las tecnologías prominentes utilizadas para el análisis de alto rendimiento de vehículos eléctricos individuales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la cuantificación y determinación del tamaño de los vehículos eléctricos aislados del tejido adiposo perigonadal de ratón y el plasma humano utilizando una tecnología innovadora para NTA que representa importantes avances en el campo. Los resultados demuestran que este método puede proporcionar datos reproducibles y válidos de concentración total de partículas y distribución de tamaño para vehículos eléctricos aislados de diferentes fuentes utilizando diferentes métodos, como lo confirma la microscopía electrónica de transmisión. La adaptación de este instrumento para NTA abordará la necesidad de estandarización en los métodos de NTA para aumentar el rigor y la reproducibilidad en la investigación de EV.

Introduction

Las vesículas extracelulares (VE) son pequeñas (0,03-2 μm) vesículas unidas a la membrana secretadas por casi todos los tipos de células¹. A menudo se les conoce como “exosomas”, “microvesículas” o “cuerpos apoptóticos” dependiendo de su mecanismo de liberación y tamaño^2. Si bien inicialmente se pensó que los VEHÍCULOS eléctricos eran simplemente un medio para eliminar los desechos de la célula para mantener la homeostasis^3,ahora sabemos que también pueden participar en la comunicación intercelular a través de la transferencia de material molecular, incluido el ADN, el ARN (ARNm, microARN), los lípidos y las proteínas^4,5, y que son importantes reguladores de la fisiología normal, así como de los procesos patológicos^{1, 5,6,7,8}.

Hay muchos métodos diferentes para aislar y cuantificar los vehículos eléctricos, que se han descrito en otra parte^9,10,11,12. El protocolo de aislamiento utilizado, así como la fuente de los vehículos eléctricos, pueden afectar en gran medida el rendimiento y la pureza de los vehículos eléctricos. Incluso la centrifugación diferencial, considerada durante mucho tiempo el enfoque “estándar de oro” para el aislamiento de exosomas, puede estar sujeta a una variabilidad sustancial que posteriormente afecta a la población de EV obtenida y a los análisis posteriores¹³. Por lo tanto, las diversas metodologías diferentes para el aislamiento y cuantificación de EV dificultan la comparación, reproducción e interpretación de los resultados de los experimentos reportados en la literatura¹⁴. Además, la liberación de EV puede ser regulada por condiciones celulares o varios factores externos. Se ha sugerido que los EV desempeñan un papel en el mantenimiento de la homeostasis celular al proteger a las células contra el estrés intracelular^15,ya que varios estudios han demostrado que el estrés celular estimula la secreción de EV. Por ejemplo, se ha reportado un aumento de la liberación de EV después de la exposición celular a la hipoxia, el estrés del retículo endoplásmico, el estrés oxidativo, el estrés mecánico, el extracto de humo de cigarrillo y la^{contaminación}del aire por partículas^{16,17,18 , 19},^20,21,22. También se ha demostrado que la liberación de EV se modifica in vivo; los ratones sometidos a una dieta alta en grasas o en ayunas durante dieciséis horas liberaron más vehículos eléctricos de adipocitos²³. Para investigar si un tratamiento o afección específica altera la liberación de EV, el número de EV debe determinarse con precisión. La evaluación de la distribución del tamaño de ev también puede indicar el origen subcelular predominante de los EV (por ejemplo, fusión de endosomas tardíos/cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática frente a la brotación de la membrana plasmática)²⁴. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos robustos para medir con precisión la concentración total y la distribución de tamaño de la preparación EV que se está estudiando.

Un método rápido y altamente sensible para la visualización y caracterización de vehículos eléctricos en solución es el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Una explicación detallada de los principios de este método y la comparación con métodos alternativos para la evaluación del tamaño y la concentración de EV se han descrito previamente^25,26,27,28. Brevemente, durante la medición NTA, los vehículos eléctricos son visualizados por la luz dispersada cuando se irradian con un rayo láser. La luz dispersa es enfocada por un microscopio en una cámara que registra el movimiento de las partículas. El software NTA rastrea el movimiento térmico aleatorio de cada partícula, conocido como movimiento browniano, para determinar el coeficiente de difusión que se utiliza para calcular el tamaño de cada partícula utilizando la ecuación de Stokes-Einstein. NTA se aplicó por primera vez a la medición de vehículos eléctricos en una muestra biológica en 2011²⁵. Hasta hace poco, solo había dos compañías principales que ofrecían instrumentos NTA comerciales²⁹ hasta la introducción del ViewSizer 3000 (en adelante, el instrumento de seguimiento de partículas) que utiliza una combinación de nuevas soluciones de hardware y software para superar las limitaciones significativas de otras técnicas NTA.

El instrumento de seguimiento de partículas caracteriza las nanopartículas en muestras líquidas mediante el análisis de su movimiento browniano y caracteriza partículas más grandes del tamaño de micras mediante el análisis de la sedimentación gravitacional. El sistema óptico único de este instrumento, que incluye iluminación multiespectral con tres fuentes de luz láser (a 450 nm, 520 nm y 635 nm), permite a los investigadores analizar una amplia gama de tamaños de partículas (por ejemplo, exosomas, microvesículas) simultáneamente. En la Figura 1se muestra un esquema de la configuración del instrumento.

Aquí, demostramos cómo realizar mediciones de distribución y concentración del tamaño de partícula de vehículos eléctricos aislados de ratones y humanos utilizando un nuevo instrumento NTA.

Figura 1: Sistema óptico del instrumento de seguimiento de partículas. El instrumento NTA ilumina partículas utilizando tres láseres con las siguientes longitudes de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. La grabación de video de la luz dispersa de partículas individuales es detectada y rastreada por una cámara de video digital orientada a 90 ° desde la cubeta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todo el trabajo con estas muestras se realizó de conformidad con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y de la Junta de Revisión Institucional. En la figura 2se muestra una descripción general esquemática del método NTA. Figura 2: Descripción general del método NTA utiliz…

Representative Results

Antes de esta demostración, la calibración del instrumento se probó por primera vez para garantizar la validez de los datos adquiridos mediante la medición de la distribución de tamaño de los estándares de perlas de poliestireno. Probamos la distribución de tamaño de cuentas de 100 nm y 400 nm utilizando los parámetros de grabación predeterminados y la configuración de procesamiento recomendada en este protocolo (Figura 8). Para el estándar de perlas …

Discussion

Aquí, demostramos un protocolo para NTA de EV para medir la distribución de tamaño de una amplia gama de tamaños de partículas simultáneamente y medir la concentración total de EV en una muestra polidispersa. En este estudio, se utilizó tejido adiposo perigonadal de ratón y plasma humano como fuente de vehículos eléctricos. Sin embargo, los VEHÍCULOS eléctricos aislados de otros tejidos o fluidos biológicos como suero, orina, saliva, leche materna, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular tambi…

Materials

1X dPBS	VWR	02-0119-1000	To dilute samples
100 nm bead standard	Thermo Scientific	3100A	To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard	Thermo Scientific	3400A	To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC901024	To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL	Qiagen	19201	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster	DustOff	DPSJB-12	To clean cuvettes
Cuvette insert	HORIBA Scientific	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig	HORIBA Scientific	–	To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water	VWR	02-0201-1000	To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables	Dell	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore Sigma	–	To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids	Thermo Scientific	B780020	To clean cuvettes
"Hook" tool	Excelta	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth	Texwipe	TX629	To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	22363344	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	–	Nanoparticle tracking instrument